Новые селективные пептидные субстраты цистеиновых пептидаз семейства папаина

• Автор: Семашко, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ЦИСТЕИНОВЫХ ПЕПТИДАЗ СЕМЕЙСТВА С1 Обзор литературы

1.1. Классификация цистеиновых пептидаз

1.2. Распространение, биологические функции и применение пептидаз семейства С1

1.3. Процессинг пептидаз семейства С1.

1.4. Структура пептидаз семейства С

1.5. Типы ферментативной активности пептидаз семейства С1.

1.6. Активный центр и механизм катализа.

1.7. Активация и ингибирование ферментов

1.8. Зона связывания пептидаз семейства С

1.9. Группы, используемые для детекции ферментативного гидролиза пептидаз.
1 Субстраты пептидаз семейства С1.
1 Специфичность пептидаз семейства С1.
1 Заключение
2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
2.1. Дизайн субстратов цистеиновых пептидаз семейства С
2.2. Химикоэнзиматический синтез субстратов цистеиновых пептидаз семейства С1
2.2.1. Химический синтез полупроизводных
2.2.2. Ферментативный синтез субстратов цистеиновых пептидаз семейства С1
2.3. Гидролиз субстратов цистеиновыми пептидазами семейства С
2.3.1. Кинетика гидролиза субстратов цистеиновыми пептидазами семейства С1
2.3.2. Селективность субстратов цистеиновых пептидаз семейства С1.
2.3.3. Постэлектрофоретическая детекция активности папаина с использованием
синтезированных субстратов
2.4. Идентификация и характеристика цистеиновых пептидаз ТепеЬпо тоШог
2.4.1. Фракционирование пептидаз ТепеЬпо тоШог
2.4.2. Идентификация цистеиновых пептидаз ТепеЬпо тоШог.
2.4.3. Субстратная специфичность цистеиновых пептидаз Т. тоШог
2.4.4. Гидролиз аналогов токсических пептидов глиадинов катепсииами из различных источников
3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
3.1. Материалы и методы
3.2. Химикоэнзиматический синтез субстратов цистеиновых пептидаз семейства папаина
3.2.1. Химический синтез фрагментов пептидной конденсации
3.2.1.1. Бензотриазоловый эфир антраниловой кислоты 5.
3.2.1.2. Метиловый эфир антранилоилЬфенилаланина
3.2.1.3. Пентафторфениловый эфир пироглутаминовой кислоты
3.2.1.4. Метиловый эфир фенилаланина РИеОМе
3.2.1.5. Метиловый эфир пирорлутамилфенилаланина
3.2.1.6. Хлоргидрат метилового эфира валина V 6.
3.2.1.7. Метиловый эфир пироглутамилвалина V.
3.2.1.8. Нитроанилид третбутилоксикарбонилБаланина
3.2.1.9. Нитроанилид третбутилоксикарбонилБглутамина
3.2.1 Хлоргидрат пнитроаничида аланина .
3.2.1 Хюргидрат пнитроаничида глутамина I
3.2.2. Ферментативный синтез субстратов с использованием нативных ферментов.
3.2.2.1. Нитроанилид пироглутамилБфенилаланилБаланина
3.2.2.2. Нитроанилид аптранилоилБфенипсиштоБаланина .
3.2.2.3. 7Амидо4трифторметилкумарин пироглутсшилБфенилалашыБаланина .
3.2.3. Ферментативный синтез субстратов с использованием иммобилизованных ферментов
3.2.3.1. Препараты иммобилизованных катализаторов
3.2.3.2. пНитроанилид пироглутамилЬфенияапаиилЬаланина
3.2.3.3. Нитроанилид пироглутамилЬвалинЬаланина V
3.2.3.4. Нитроанилид антранилоилЬфенилаланилЬалаиина .
3.2.3.5. 7Амидо4трифторметшкумарин пироглутамияБфенилаланилБаланина
3.2.3.6. 7Амидо4метилкумарии пироглутамилБфенилаланилБалапина
3.3. Определение активности пептидаз и кинетических параметров гидролиза
субстратов.
3.3.1. Измерение активности пептидаз по хромогенным субстратам.
3.3.2. Измерение активности пептидаз по флуорогенным субстратам.
3.3.3. Определение кинетических параметров гидролиза субстратов цистеиновыми пептидазами
3.3.4. Титрование активных центров цистеиновых пептидаз
3.4. Фракционирование пептидаз из средней кишки ТепеЬпо тоШог
3.5. Электрофорез препаратов пептидаз и постэлектрофорстическое тестирование протсолитичсской активности
3.5.1. Нативный электрофорез и постэлектрофоретическая детекция активности.
3.5.2. Электрофорез по Леммли 7 с последующим окрашиванием серебром
ВЫВОДЫ.
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Родоначальником этого семейства является растительная пептидаза папаин. Этот фермент, а также близкие к нему цистеиновые пептидазы из тропических фруктов бромелаин и фицин имеют важпое практическое значение и используются в пищевой промышленности, фармакологии, научных исследованиях. Большую группу цистеиновых пептидаз семейства С1 составляют цистеиновые лизосомальные катепсины млекопитающих и человека. Цистеиновые катепсины не только осуществляют неселективную лизосомальную деградацию белков, но и принимают участие в более специфических процессах как в нормальных физиологических условиях активации проферментов, созревании гормонов, презентации антигенов и т. Большой интерес представляют также цистеиновые пептидазы некоторых групп насекомых, у которых кагсисинподобные ферменты выполняют пищеварительную функцию. Сведения об организации и эволюции пищеварительной системы насекомых важны как с фундаментальной точки зрения, так и для разработки экологически безопасных методов борьбы с насекомымивредителями. Идентификация и характеристика цистеиновых пептидаз семейства С1 папаина в природном материале требует их селективной детекции. Однако синтетические субстраты, обычно используемые для определения активности этой группы ферментов, больше удовлетворяют специфичности сериновых трипсиноподобных пептидаз. Эго снижает как селективность, так и чувствительность корректного определения активности пептидаз семейства папаина. В связи с этим весьма актуальной задачей является разработка селективных и эффективных субстратов для тестирования активности ферментов этого семейства, как в гомогенном состоянии, так и в составе сложных ферментных смесей. Примером таких многокомпонентных систем служит комплекс пищеварительных пептидаз ряда насекомыхвредителей зерновых запасов. Наиболее изученным представителем этой группы насекомых является большой мучной хрущак ТепеЬпо тоШог, пищеварительный комплекс которого содержит цистеиновые и сериноные пептидазы. Ключевую роль в протеолизе пищевых белков играют цистеиновые пептидазы. Основными пищевыми белками Т. Шог являются главные запасные белки семян пшеницы глиадины, которые в значительных количествах присутствуют и в пищевом рационе человека. ЖКТ целиакию диагносцируемое у 2 населения. Отдельные пептиды глиадинов, вызывающие аутоиммунный ответ у больных целиакисй, устойчивы к действию пищеварительных ферментов человека и большинства известных пептидаз. Мы предположили, что способностью гидролизовать токсические пептиды глиадинов могут обладать главные пищеварительные цистеиновые пептидазы этого насекомоговредителя. На сегодняшний день лекарств от целиакии нет. В связи с этим, одной из целей данной работы являлась идентификация и исследование субстратных свойств цистеиновых пептидаз из Т. Шог, которые могут иметь весьма важное значение как потенциальные лекарственные средства в лечении целиакии. Основной целью данной работы являлся дизайн, синтез и применение новых селективных пептидных субстратов для идентификации и характеристики субстратной специфичности цистеиновых эцдопептидаз семейства С1. Использованы международные однобуквенные и трехбуквенные сокращения названий аминокислот. Все аминокислоты в Ьряда, если не оговорено особо. Цистсиновыс пептидазы это пептидазы, важную роль в каталитической функции которых играет аминокислотный остаток цистеина. Термин пептидазы введен в Классификацию ферментов по рекомендации Номенклатурного комитета Международного Союза Биохимии и молекулярной биологии ЮВМВ как синоним термина гидролазы пептидов, обозначающих ферменты, которые расщепляют пептидные связи 1. Классификация по катализируемой реакции позволяет описывать активность ферментов. Все пептидазы катализируют расщепление пептидной связи, однако они могут катализировать гидролиз не всех, а только строго определенных пептидных связей рис. Иили Сконцевых групп, либо обеих одновременно. Ы или Сконцов субстрата, однако эти ферменты часто действуют близко к одному или другому концу. Некоторые омсгапсптидазы гидролизуют не апептидные связи.