Изучение малых стабильных молекул РНК - компонентов аппарата трансляции

• Автор: Зверева, Мария Эмильевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 116 с. : ил.

1 Ген тмРНК

2. Структура тмРНК

3. тРНКподобная структура

4 мРНКподобная часть

5. Особенности структуры матричной часто тмРНК

6. Внутренняя область.

7. Функционирование тмРНК.

ГЛАВА П. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Определение белкового партнера тмРНК и изучение тмРНК

белковото комплекса

1.1. Получение тмРНК, содержащей 4тноурилин

1 2. Фотоактивируемое сшивание в Б0 экстракте
1 3. Идентификация белка, сшивающегося с модифицированной
тмРНК в экстракте
1.4. Изучение комплекса тмРНК с изолированным РРГи.
1.5. Исследование взаимодейавия тмРНК с ЕРТи в комплексе тмРНКЕРТиООР
2 Изучение роли рРНК Ксо в функционировании рибосомы
2.1 Получение мутантных 5 Б рРНК.
2.2. Реконструкция Б рибосомных субчастоц с мутантной рРНК
3. Установление функциональной гомологии между 5Б рРНК
связмвающими белками Т.ОкгторИгЬх и Исо1т.
ГЛАВА III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Реактивы
2. Биопрепараты .
3. Синтез тмРИК с помощью Т7РНКполимеразы
4. Синтез тмРНК. содержащей 4тиоуридин
5. Т1фингерпринты.
6. Комплексообразование и фотоактивируемое химическое сшивание
7. Анализ сшнвшсгося белка
8. Измерение константы ассоциации комплекса тмРНК и ЕРТи
9. Образование комплекса тмРНК и ЕРТиСЭР.
. Футпринтинг
. Определение позиции сшивки .
Ссквенированне и анализ сшивки тмРИК и ЕНТиСЭР с помощью
реакции обратной транскрипции.
. Синтез ДНК матрицы для Т7 транскрипции 5Б рРНК с помощью полимеразной цепной реакции.
. Синтез 5 рРНК с помощью Т7РНКполимсразы .
. Дефосфорнлированис 5Я рРНК
. 5концевое мечение 5Б рРНК
. Выделение Б и 5Б рРНК из Б рибосом.
. Разделение 8 и 5Б рРНК в градиенте градиенте концентрации сахарозы
. Выделение суммарного белка ТР из 8 субчастии рибосомы
. Реконструкция Б субчаспш рибосомы
. Выделение реконструированных 8 рибосомных субчастиц
Выделение 8 рибосом.
. Зональное центрифугирование для выделения Б, ЗОБ и Б.
ЕРАТУРА
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ЛТР адепозин5трнфосфах
СМСТ 1 циклогсксилморфолиши4зтилкарбодиимидметилп
толуолсульфонат
СТР иитидин5трифосфат
гуанозин5дифосфат
уанаднн5ЧР,Уимидотрифосфат
гуанознн5трнфосфат
М2гидроксизтилпипсразинМ2этансульфоноиая кислота элонгационный фактор массспектрометр ия фосфоенолпнруваг рк пссвдоузсл
i трисгидроксимстиламнномстан 4тиоуридин5трифосфат додецилсульфагг натрия уридин5трифосфат РСА рентгеноструктурный анализ ПААТ полиакриламидный гель ПЦР полимеразная цепная реакция УФ ультрафиолетовый свет ЯМР яясрномагнитный резонанс
ВВЕДЕНИЕ


В последнее время достигнут определенный успех в РСА сложных РНКбелковых комплексов, что обусловлено переходом на изучение объектов из термофильных микроорганизмов. В то же время, большинство биохимических данных получено для рибосом и их компонентов, выделенных из ЕсоЧ. Первым шагом при сопоставлении структур РНКбелковых комплексов, полученных с помощью РСА, и данных биохимических исследований должно быть установление структурного и функционального соответствия белков из Е. Ч и термофильных организмов. Поэтому одной из целей данной работы является установление такою соответствия между 5 рРНК связывающими белками Е. Ч и . Несмотря на то. РНК активно изучают на протяжении многих лет. Лишь недавно в нашей лаборатории при использовании метода фотоаффинного химического сшивания были найдены контакты 5 рРНК с функционально важными районами рРНК. Основание , локализованное в петле 5 рРНК, образует сшивку нулевой длины с основаниями А0 и С в рРНК, локализованными в непосредственной близости от участка связывания фактора элонгации и района пептидилтрансферазного кольца, соответственно. РНК в данной работе был использован метод сайтнаправленного мутагенеза. Второй объект данной работы тмРИК впервые была обнаружена в клетках Е. Н более лет назад, но сс функция была установлена только в голу тмРНК несет в себе черты мРНК и тРНК Матричная часть тмРНК кодирует ппттд, являющийся сигналом узнавания специфическими протеиназами. РНКподобная часть может быть аминоацилирована. В аминоацилированном состоянии тмРНК взаимодействует с рибосомой, которая изза деградации матричной РНК не может продолжать синтез белка и терминировать на обычном стопкодоне тмРНК узнает такие рибосомы, приносит дополнительный аминокислотный остаток в растущую полипеггидкую цепь и замещает поврежденную мРНК. Трансляция продолжается по матричной части тмРНК, завершающейся стопколоном, на котором рибосома может терминировать с помощью обычных клеточных механизмов. Кроме того, синтезированный таким образом белок будет нести тапеитид и расщепляться клеточными протеиназами. Однако, несмотря на интенсивное исследование тмРНК, начавшееся после установления сс функции, до сих пор многие вопросы остаются открытыми Например, неизвестна пространственная структура тмРНК и механизм узнавания заблокированных рибосом. Способ, которым тмРНК доставляется в рибосому, так же остается неизвестным Все тРНК приносятся в рибосому белковыми факторами Целью . РНК, и исследование полученных тмРНКбелковых комплексов. Анализ литературы, проведенный в данной работе, посвящен тмРНК, так как до последнего времени больших обзоров о тмРНК не было опубликовано в отличие от рРНК. Глава . РНК РНК и ее структура. I. Ген тмРНК. РНК в . Это мононистронный ген. На январь года была определена последовательность тмРНК из различных источников 4. Большая часть информации для последовательностей была извлечена из полностью отсеквеннрованных геномов различных микроорганизмов, ряд последовательности был получен при помощи метода ПЦР с использованием праймеров к тРНКподобной консервативной части тмРНК 5. К настоящему моменту тмРНК обнаружена у эубактсрий различных типов Структуры, подобные тмРНК, в архсбактсриях и эукариотических организмах найдены не были Гены тмРНК были также идентифицированы в геноме некоторых органелл в цианелле из СухоюрНога x 4 и в хлоропластах из ii 4. Ген необходим для клеточного росга. Рост клеток . РНК был инакгивирован при помощи вегавки гена хлорамфеннколацетил зрансфсразы, замедлен 6. РНК особенно важна для росга клеток при повышенной температуре. Клетки . РНК при С и С росли медленнее, чем штамм дикого типа, а при С их рост практически прекращался. Косвенным подтверждением важности тмРНК для бактериальной клетки является факт присутствия ее гена в геноме iii 7, наименьшем из всех известных бактериальных геномов. Структура тмРНК. Размер тмРНК варьируется от 9 нов i 8 до 1 н. Длина тмРНК в . На рис. РНК i, основанная на сравнительном филогенетическом анализе нуклеотидных последовательностей тмРНК из ти различных организмов 5.