Влияние повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование ДНК-метилтрансфераз SssI (Spiroplasma) и Dnmt3a (мыши)

• Автор: Мальцева, Диана Васильевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 112 с. : ил.

Введение

Глава 1. Повреждения остатков гуанина в ДНК Обзор литературы

1.1. Повреждение ДНК активными формами кислорода

1.1.1. Структура ДНК, содержащей Яохов

1.1.2. Репарация 8охоОДНК

1.1.3. Влияние 8охоО на процессы, протекающие в клетке

1.2. Повреждение ДНК метилирующими агентами

1.2.1. Структура ДНК, содержащей теО.

1.2.2. Ответ клетки на присутствие УтеС в ДИК

1.2.3. Цитотоксичность теО.

1.3. Действие на ДИК бензонирсиа канцерогенного полицикличсского ароматического углеводорода.
1.3.1. Структура ДНК, содержащей траис и исВдРД2сЮадд у кты
1.3.2. Репарация ВдРДНК.
1.3.3. Взаимодействие ВяРДНК с ДНКсвязывающими ферментами
Глава 2. Влияние повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование ДНКметилтрансфераз Збб 5горштш и ЭппйЗа мыши Обсуждение результатов
2.1. Взаимодействие ОппНЗаСО и М.Збб с ДНК, содержащей 8охоО
2.1.1. Выделение ОтгПЗаСР и
2.1.2. Дизайн и характеристика аналогов субстратов.
2.1.3. Начальные скорости метилирования ИтгиЗаСП ДНКдуплексов, содержащих 8охоСг
2.1.4. Связывание ЭшШЗаСО с ДНКдуплексами, содержащими 8охоО
2.1.5. Интегральная кинетика метилирования ОппДЗаСО ДНКдуплексов, содержащих 8охоО.
2.1.6. Метилирование М.Зяв ДНКдуплексов, содержащих Яохов.
2.1.7. Молекулярные основы влияния Яохов на взаимодействие
ОшШЗаСО и М.8вя1 с ДНК
2.2. Взаимодействие ПштЗаСБ и М.Звв с ДНК, содержащей шеО
2.2.1. Используемые ДНКдуплсксы.
2.2.2. Начальные скорости метилирования ОппИЗаО ДНКдуплексов, содержащих шеО
2.2.3. Связывание ОштиЗаСЭ с ДНКдуплексами, содержащими теО
2.2.4. Интегральная кинетика метилирования БппиЗаСО ДНКдуплсксов, содержащих шеС.
2.2.5. Метилирование М.БбзГ ДНКдуплексов, содержащих ОбтеО
2.2.6. Молекулярные основы влияния ОбтеО на взаимодействие
ОппИЗаСО и М с ДНК.
2.3. Взаимодействие М.8з1 с ДНК, содержащей сгВяРМ2сЮ.
2.3.1. Связывание М.Вяя с ДНКдуплексам и, содержащими мсВяРЛЮ.
2.3.2. Метилирование ДНКдуплексов, содержащих мсВяРЛт2сЮ.
2.3.3. Сравнение влияния цис и трансВаРК2 ддктв на функционирование
2.4. Заключение
Глава 3. Экспериментальная часть.
3.1. Реактивы и материалы
3.2. Приборы и методы
3.3. Общие методики
3.3.1. Формирование ДИКдуилексов
3.3.2. Плавление ДНКдуплексов.
3.3.3. Приготовление компетентных клеток.
3.3.4. Выделение ОпгтпЗаСО
3.3.5. Выделение М.Бяз
3.3.6. Ферментативное 5фосфорилирование синтетических олигонуклеотидов
3.3.7. Выделение олигонуклеотидов из геля
3.3.8. Определение концентрации активных молекул МЭбб с помощью метода поляризации флуоресценции
3.3.9. Определение комплексов ОптмЗаСП с ДИК и АбоНсу с помощью метода поляризации флуоресценции
3.3 Определение Ка комплексов М.8зд1 с ДНК и АбоНсу методом равновесного конкурентного связывания с ферментом двух различных ДНКдуплексов с помощью торможения в геле
3.3 Определение начальных скоростей метилирования ОппйЗаСО ти звенных ДНКдуплексов
3.3 Метилирование ОппнЗаСО ти звенных ДНКдуплексов в условиях одного оборота интегральная кинетика метилирования.
3.3 Определение начальных скоростей метилирования М.8яз1 ти звенных ДНКдуплексов .
3.3 Определение начальных скоростей и каталитических констант скорости
реакции метилирования МБэб ВяРсодсржащих ДНКдуплексов
Список литературы.
Список сокращений
МТаза ДНКметилтрансфераза
С5МТаза ДНКметилтрансфераза, метилирующая атом углерода С5 остатка цитозина
5аденозильметионин
5аденозильгомоцистеин
3 каталитический домен
8x 7,8дигидро8оксогуанин
8x 7,8дигидро8оксо2дезоксигуанозин
метил гуанин
метил2 дезокси гу ан ози
ПАУ полициклические ароматические углеводороды
ВР бснзоапирсн
бснзояпкрсндиолэпоксид
система репарации мистатчей i i
ядерный антиген пролиферирующих клеток ii i
ПААГ полиакриламидный гель
карбоксифлуоресцеин
ДТТ 1,4дитиотреитол
БСА бычий сывороточный альбумин
ИПТГ изопропилРОтиогалактопиранозид
ХС ксиленциаиол
ВРВ бромфеноловый синий
ЭД ГА этилендиаминтстраацстат натрия
Трис трисгидроксиметиламинометан
ДСП додецилсульфат натрия
т5С 5метил цитозин
5 5метил2дезоксицитидин
константа диссоциации , каталитическая константа
кы константа реакции метилирования в условиях одного оборота i v v0 начальная скорость метилирования
V относительная начальная скорость
I температура плавления
Р поляризация флуоресценции
оптическая единица
РСА рентгеноструктурный анализ
ЯМР ядерномагнитный резонанс
ВЭЖХ высокоэффективная жидкостная хроматография
Для обозначения нуклеотидных звеньев, олигонуклеотидов использовали символы, рекомендованные комиссией по номенклатуре Международного союза чистой и прикладной химии I и Международною союза биохимиков I.
Введение


Мишенями для повреждающих агентов во многих случаях служат остатки гуанина. Основным источником эндогенных повреждений гуанина являются активные формы кислорода, приводящие преимущественно к образованию 7,8дигидро8оксогуапииа 8охоО биомаркера окислительного стресса. Взаимодействие ДНК с некоторыми продуктами катаболизма, а также метилирующими агентами, содержащимися в окружающей среде, приводит к появлению в ДНК очень токсичного для клетки О метилгуанина СтеС. Среди загрязнителей окружающей среды одним из наиболее распространнных является бензояпирен ВР. В процессе метаболизма в эукариотических клетках ВР активируется до реакционносиособных диолэпоксидов, которые ковалентно присоединяются к ДНК по экзоциклической аминогруппе гуанина с преимущественным образованием цис и шлсстереоизомерных ВлРЛг2сЮаддуктов. Действие окислительных и метилирующих агентов и ВР на остатки гуанина в ДНК клеток млекопитающих может нарушить процесс ферментативного метилирования Свпоследоватсльиостсй ДНК по атому углерода С5 остатков цитозина. Метилирование ДНК играет важную роль в регуляции многих клеточных процессов, в том числе транскрипции генов. Изменение активности генов, часто ассоциированное с аберрантным метилированием ДНК, является фактором, запускающим развитие многих заболеваний, в числе которых рак, диабет, заболевания сердечнососудистой системы. В клетках животных и человека метилирование Свпоследоватсльностей в ДНК осуществляется С5ДНКметилтрансферазами МТазами ЭпшН, ЭппЛЗа и ОппйЗЬ. Эти ферменты обладают сложной структурой, а молекулярные механизмы их действия ещ мало изучены. Показано, что все три МТазы важны как для установления, так и для поддержания нормального уровня метилирования ДНК. Представляется важным изучение влияния повреждений ДНК, приводящих к образованию 8охоО, шеО и ВаРЛЮ, на функционирование МТаз. Объектом исследования в настоящей работе стал каталитический домен ОппИЗа мыши ОшШЗаСО. В качестве второго объекта была выбрана прокариотическая МТаза МО, которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК короткую ССпоследовательность и традиционно используется в качестве модельного фермента при изучении эукариотических МТаз. Целыо работы явилось определение влияния повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование каталитического домена ЭппйЗа мыши и М. ЗбзГ из 5р1гор1ста. В работе решались следующие задачи 1 исследование влияния 8охоО, шеО и цисВ а РЛ2сЮ на различные стадии реакции метилирования ДНК каталитическим доменом ПпгШЗа и . Глава 1. Геном живых организмов постоянно подвергается эндогенному и экзогенному воздействию реакпионпоспособных веществ, которые взаимодействуют с ДНК, изменяют с структуру и нарушают воспроизведение закодированной в ней информации 1. Так, некоторые побочные продукты естественных клеточных процессов дыхания, метаболизма и биосинтеза способны окислять и алкилировать гетероциклические основания. Также в физиологических условиях со значительной скоростью происходит спонтанное дезаминирование цитозина и гидролиз гликозидных связей пуриновых дезоксирибонуклеотидои 1,2. Воздействие радиации, УФлучей, канцерогенных веществ, содержащихся во внешней среде и используемых при химиотерапии рака, приводит к образованию двухцепочечных разрывов в ДНК, пиримидиновых димеров, аддуктов ДНК с объмными заместителями и множеству других повреждений 1,. В данном обзоре будут рассмотрены особенности структуры, репарации и взаимодействия с ДНКсвязывающими ферментами ДНК, содержащей 7,8днгидро8оксогуанин и аддукты бензоапирена с гуанином, образующиеся при эндогенном и экзогенном воздействии соответственно, а также Обметилгуанин, образующийся при действии метилирующих агентов, содержащихся в клетке, в окружающей среде и в химиотерапевтических препаратах. Клеточный метаболизм является постоянным источником активных форм кислорода iv x i, , способных окислять ДНК 7,8. Основным источником в клетке при нормальных условиях является ускользание электронов в процессе их передачи по электроннотранспортной цепи в митохондриях и эндоплазматическом ретикулумс 9,.