Синтез нейтральных неогликолипидов для создания модульных систем доставки нуклеиновых кислот

• Автор: Иванова, Екатерина Алексеевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений:
1. Литературный обзор
1.1. Введение
1.2. Основные стадии транспорта нуклеиновых кислот
1.3. Модульные липидные транспортные системы
1.3.1. Связывающий и защищающий модуль МЛТС
1.3.2. Биосовместимый и стабилизирующий модуль МЛТС
1.3.3. Адресный модуль МЛТС
1.3.3.1. Углеводные лиганды для нацеленной доставки НК
1.3.3.1.1. Катионные углеводсодержащие амфифилы
1.3.3.1.2. Эффект мультивалентности в углеводном распознавании на примере поливалентных нейтральных углеводсодержащих амфифилов
1.3.3.1.3. Создание липосомальных систем доставки НК, содержащих поливалентные гликоконъюгаты
1.3.3.2. Фолиевая кислота как лиганд для нацеливания на опухолевые клетки
1.3.3.3. Другие лиганды для направленной доставки в клетки-мишени
1.3.4. Дополнительные функциональные модули МЛТС, увеличивающие эффективность доставки НК
1.4. Заключение
2. Результаты работы и их обсуждение
2.1. Синтез связывающих модулей МЛТС - катионных амфифилов
2.1.1. Синтез монокатионных амфифилов
2.1.2. Синтез поликатионного гемини-амфифила
2.2. Синтез адресных модулей МЛТС - нейтральных неогликолипидов
2.2.1. Синтез моновалентных неогалактолипидов
2.2.2. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе разветвленных матриц различного

2.2.2.1. Синтез гидрофобных предшественников
22.2.2. Синтез углеводных предшественников
2.2.3. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе L-глутаминовой кислоты
2.2.4. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе 1,3-диаминопропан-2-ола
2.2.5. Синтез бивалентных нейтральных неогалактолипидов на основе спермина
2.3. Физико-химические характеристики и биологические свойства адресных МЛТС, полученных на основе катионных амфифилов и синтезированных нейтральных бивалентных

неогалактолипидов
2.3.1. Выбор связывающего модуля для адресных МЛТС
2.3.1.1. Определение физико-химических характеристик катионных липосом и их комплексов с плазмидной ДНК
2.3.1.2. Изучение цитотоксичности катионных липосом и доставки с их помощью плазмидной ДНК
2.3.2. Выбор адресного модуля для МЛТС, нацеленных на асиалогликопротеиновый рецептор
2.3.2.1. Определение физико-химических характеристик адресных МЛТС
2.3.2.2. Изучение агглютинации адресных МЛТС в присутствии лектина ИСАцо
3. Экспериментальная часть
3.1. Основные методы
3.2. Синтез связывающих модулей МЛТС
3.2.1. Синтез монокатионных амфифилов
3.2.2. Синтез поликатионного амфифила
3.3. Синтез адресных модулей МЛТС
3.3.1. Синтез моновалентных неогалактолипидов
3.3.2. Синтез бивалентных неогалактолипидов
3.3.2.1. Синтез гидрофобных и углеводных предшественников
3.3.2.2. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе Ь-01и
3.3.2.2. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе 1,3-диаминопропан-2-ола
3.3.2.3. Синтез бивалентных неогалактолипидов на основе спермина
3.4. Биологические исследования
Выводы
Список литературы
Список сокращений
BGTC - бисгуанидин-трен-холестерин Con А - лектин конканавалин А COSY
DC-Chol - ЗР-[А-(АА,-диметиламиноэтил)карбамоия]холестерин DMRIE - rac-N- [2,3 -ди(терадецилокси)проп-1 -ил] -Л-(2-гидроксиэтил)-Л,г, N-диметиламмоний бромид
DOGS - диоктадспиламидо-Л-(6-спсрмилкарбонил)глицин DOPE - 1,2-диолеоил-5'и-глицеро-3-фосфоэтаноламин
DOTMA - rac-N-(2,3-ди(олеилокси)проп-1-ил)-А,А,А-триметиламмоний хлорид DOTAP - гш>А-[2,3-ди(олеоилокси)проп-1-ил]-А,А, А-триметиламмоний хлорид DOSPA
NLS - сигнал ядерной локализации
N/P - соотношение количества положительно заряженных групп амфифила к количеству отрицательно заряженных фосфатных групп нуклеиновой кислоты ROESY -
siRNA - малая интерферирующая РНК
АГП-асиалогликопротеин
АСГПр - асиалогликопротеиновый рецептор
ДЛС - динамическое лазерное светорассеяние
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота
ИП - индекс полидисперсности
КА - катионный амфифил
КК - Купферовские клетки
КЛ - катионные липосомы
КССВ - константа спин-спинового взаимодействия
МЛТС - модульная липидная транспортная система
НК - нуклеиновая кислота
ПЭГ - полиэтиленгликоль
РНК - рибонуклеиновая кислота

ТФ -трансферрин
ФК - фолиевая кислота
ЭСП - эндотелиальные синусоиды печени
ЯМР - ядерный магнитный резонанс

амфифильные (Та!, УР22 и рАЫТР). Анализ аминокислотных последовательностей проникающих пептидов не выявил их гомологии, однако, было отмечено, что в них всегда присутствуют молекулы аргинина. Механизм проникновения в клетку пептидов окончательно не выяснен. Ряд пептидов был успешно использован для доставки белков и НК в клетки (таблица 1.2) [111].
Таблица 1.2. Проникающие пептиды для доставки НК.
Название Происхождение Тип переносимого груза
Tat Tat-белок вируса ВИЧ-1 Белки / б1КЫА / липосомы
Пенетратин Г омеодомен зШМА / липосомы
Транспортан Химерный белок Г аланин-мастопаран Белки / вЖЛА
MPG HIV Gp41-SV40 NLS вЖИА / олигонуклеотиды/ плазмидные ДНК
PPTG1 Химерный Плазмидные ДНК
Полиаргинин Химерный Белки / эНГЛА / олигонуклеотиды / плазмиды
рСТ (9-32) Кальцитонин человека Белки /плазмидные ДНК
Ковалентным связыванием проникающих пептидов с олигонуклеотидами были получены конъюгаты, способные эффективно проникать через клеточные мембраны [112], однако, в некоторых случаях для подобных конъюгатов наблюдается потеря биологической активности [113]. Таким образом, стратегия, предполагающая нековалентное связывание проникающих пептидов с НК, является более перспективной с точки зрения сохранения НК своего биологического воздействия [114, 115]. Некоторые исследователи полагают, что для доставки ДНК достаточно образования электростатического комплекса между кислотой и ТаНпептидом [116]. Однако было показано, что использование 11-звенного ТаТпептида не приводит к трансфекции клеток, если только пептид не был модифицирован по С- и 14-концевым аминокислотам остатками цистеина [117]. Слабое проникновение комплексов ТаЬ пептида с ДНК в клетки может быть связано с их слабым взаимодействием с клеточной мембраной. Добавление к таким комплексам небольшого количества катионных липосом может существенно увеличить эффективность трансфекции [118]. Альтернативным подходом является ковалентное присоединение ТаЬпептида к поверхности липосом [119].
Согласно механизму трансфекции, липоплексы захватываются клетками посредством эндоцитоза, в результате чего они оказываются в эндосомах. Относительно низкую трансфицирующую активность катионных липосом часто связывают с неэффективным высвобождением липоплексов из эндосомального окружения. Кроме того, для проявления биологического действия НК должна произойти диссоциация комплекса. Одним из подходов для решения перечисленных проблем является включение в состав модулей МЛТС стимул-