Разработка методов иммобилизации и детекции фрагментов ДНК на микрочипах

• Автор: Шляпников, Юрий Михайлович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 111 с.

1. Технологии изготовления ДНКмикрочипов.

1.1. Синтез олигонуклеотидов i i.

1.2. Постсинтетическая иммобилизация олигонуклеотидов

1.2.1. Методы модификации стеклянных подложек

1.2.2. Методы иммобилизации на полимерных подложках

1.2.3. Методы иммобилизации на полисахаридах.

1.2.4. Методы определения поверхностной плотности аминогрупп.

2. Детекция сигнала в гибридизационном анализе.

2.1. Прямые методы.

2.2. Детекция радиоактивных меток

2.3. Детекция ферментных меток.

2.4. Флуоресцентная детекция.
3. Активные методы проведения гибридизационного анализа
4. Заключение и постановка задачи
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Материалы и оборудование
1.1. Реактивы
1.2. Подложки
1.3. Олигонуклеотиды.
1.4. Оборудование и программное обеспечение
2. Очистка стеклянных подложек.
3. Модификация стеклянных подложек в растворе
4. Модификация стеклянных подложек в газовой фазе
5. Щелочной гидролиз поверхности ПММА
6. Модификация поверхности ПММА действием ГМДА в растворе
7. Модификация поверхности ПММА действием паров ГМДА.
8. Модификация поверхности полимеров действием олигомеров АПТЭС. .
9. Измерение краевого угла смачивания поверхности водой
. Определение плотности аминогрупп на поверхности активированных стекол
. Иммобилизация олигонуклеотидных зондов на поверхности стеклянных и полимерных подложек.
. Гибридизация олигонуклеотидов и ПЦРпродуктов на микрочипах.
.1. Гибридизация комплементарных зондам олигонуклеотидов.
.2. Гибридизация продуктов ПЦР
. Детекция биотиновой метки с помощью пероксидазной цветной реакции
. Детекция флуоресцентной метки
. Исследование стабильности активированных подложек и ДНКмикрочипов при хранении
. Детекция с использованием суперпарамагнитных частиц
.1. Классический метод
.2. Активный метод.
. Определение отношения сигналшум.
. Изготовление полимерных пленок на подложках.
. Определение неспецифической адгезии
. Изготовление подложек с декстрановым покрытием.
. Изготовление ДНКмикрочипов на подложках с декстрановым покрытием.
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
4.1. Исследование ДНКмикрочипов на стеклянных подложках.
4.2. Изготовление ДНКмикрочипов на полимерных подложках.
4.3. Детекция с помощью магнитных частиц в гибридизационном анализе.
4.4. Изготовление ДНКмикрочипов на подложках с декстрановым покрытием.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРУЕМЫХ РАБОТ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ


ДНКзондов выбор способа детекции сигнала и соответствующего детектора отработка условий проведения анализа, включая оптимизацию процедуры пробоподготовки, амплификации анализируемых последовательностей, процесса гибридизации и последующих отмывок . В последнем случае определенная сложность состоит в необходимости учета влияния на термодинамику и кинетику гибридизации таких факторов как свойства поверхности подложки, ее заряд и потенциал, плотность иммобилизации олигонуклеотидов и степень их пространственной доступности и др. Настоящая работа направлена на решение некоторых из изложенных выше проблем и посвящена сравнительному изучению различных способов изготовления подложек для ДНКмикрочипов и иммобилизации на них олигонуклеотидов, а также разработке нового метода детекции сигнала в гетерофазном гибридизационном анализе. ГЛАВА 2. В данном обзоре литературы предпринята попытка отразить историю развития и современное состояние исследований, относящихся ко всем направлениям настоящей работы. Очевидно, что такой обзор, скорее всего, будет в значительной степени поверхностным, учитывая огромный объм накопленной за последние несколько десятков лег информации по этой проблематике см. Тем не менее, этот выбор представляется более предпочтительным, чем подробное освещение какого либо одного узкого раздела работы, поскольку существенно облегчает обсуждение всех полученных результатов и позволяет адекватно оценить их в сравнении с другими аналогичными исследованиями. Технологии изготовления ДНКмикрочипов. Так сложилось исторически, что подавляющее большинство используемых при изготовлении ДНКмикрочинов методов химической модификации поверхностей и последующей ковалентной иммобилизации на них олигонуклеотидов или фрагментов ДНК были разработаны для пористых материалов различной природы. На протяжении почти всей второй половины прошлого века преимущественной целью этих разработок являлись носители для жидкостной хроматографии прежде всего, ВЭЖХ как неорганической природы главным образом, силикагели и пористые стекла , так и на основе разнообразных полимерных материалов . Интенсивный поиск последних в значительной степени был обусловлен необходимостью решения весьма актуальных для данного периода времени задач по фракционированию белков и нуклеиновых кислот . Некоторые из этих носителей послужили в качестве подложек в первых работах по изготовлению ДНКмикрочипов . Эта проблема не заслуживала бы отдельного упоминания, если бы не два обстоятельства. Первое состоит в необычайном многообразии предложенных вариантов как исходных матриц, так и структур линкеров, соединяющих их с 3концевым как правило нуклеозидом . Второе заключается в том, что производство целого ряда ДНКмикрочипов основано на химическом синтезе олигонуклеотидных зондов на поверхности подложки i i, о чем будет сказано ниже. Несмотря на то что, как уже отмечалось выше, при изготовлении ДНКмикрочипов применяются химические процессы, идентичные разработанным ранее для пористых носителей, условия их протекания и критерии оценки конечного результата совершенно различны. Такое различие обусловлено прежде всего двумя взаимосвязанными характеристиками, применимыми, впрочем, только к пористым материалам, удельной поверхностью и размером пор. Наличие высокоразвитой поверхности, достигающей нескольких сотен мг , и пор в широком диапазоне размеров от единиц до сотен нм в диаметре, с одной стороны, придат этим материалам уникальные свойства и существенные для определенных целей преимущества, а с другой создат значительные, часто непреодолимые, стерические барьеры, когда речь заходит о процессах, сопряженных с массопереносом диффузией, например, в ходе химической модификации твердой фазы. Необходимо отметить, что те же проблемы в той или иной степени характерны и для объмных трхмерных гелевых структур, в частности, полиакриламидных гелей см. Существует два основных способа изготовления ДНКмикрочипов первый синтез олигонуклеотидов i i, непосредственно на микроматрице второй нанесение и, как правило, ковалентное связывание с поверхностью микрочипа предварительно синтезированных олигонуклеотидов или фрагментов ДНК .