Факторы, определяющие рибонуклеазную активность миметиков рибонуклеаз: структура химических рибонуклеаз, последовательность и пространственная организация РНК

• Автор: Тамкович, Николай Вячеславович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 151 с. : ил.

Структура белка стабилизирована четырьмя дисульфидными мостиками, в формировании которых участвуют все восемь цистеинов молекулы . Большой вклад в определение структуры РНКазы А и понимание е функционирования внесло получение кристаллов комплексов фермента с нуклеиновой кислотой, а так же с аналогами субстратов и продуктами реакции. Были исследованы комплексы РНКазы А со следующими олигонуклеотидами брА4 , . Т4 , сАрТрАрАрО и с динуклеотидами бСрА , фСрС и Ср0 , . РгоЭЗ . Рис. Трхмерная структура рибонуклеазы А . Активный центр фермента условно разделн на субсайты группы аминокислотных остатков , , входящие в состав субсайта выполняют общую функцию Рис. Выделяют две группы субсайтов В и Ртипа В1, В2 и ВЗ это субсайты, взаимодействующие с гетероциклическими основаниями субстрата и отвечающие за связывание с субстратом и селективность действия фермента Р1, Р0, Р1 и Р2 это субсайты, взаимодействующие с фосфатными группами РНК и отвечающие за неспецифическое связывание с субстратом и катализ, осуществляемый в субсайте Р1 , . Одним из основных структурных элементов фермента является его активный центр, расположенный в субсайте Р1. Р1 субсайт содержит 5 аминокислотных остатков , каждый из которых необходим для эффективного функционирования РНКазы А замена любого из них приводит к значительному снижению или потере ферментом рибонуклеазной активности. ТЪг. ГЬсШ
. АмТ
Рис. Схематическое изображение взаимодействия РНК с субсайтами РНКазы А. РНК, катализируемой панкреатической рибонуклеазой. Гистидины, входящие в активный центр фермента, являются важнейшими аминокислотами, определяющими каталитическую активность РНКазы А. Алкилирование одного из них приводит к полной потере рибонуклеазной активности фермента , . Этот профиль считается классическим и согласуется с механизмом, предполагающим участие в реакции двух титруемых остатков, один из которых находится в протонированной, а другой в депротонированной форме. Большое число исследований посвящено выяснению принципиального вопроса имидазол какого из гистидинов находится в протонированной, а какого в депротонированной форме. Для этого, используя рекомбинантную ДНК, были получены мутантные формы РНКазы А, в которых один из гистидинов в или 9 положениях был замещен на аланин . Сравнение величины i в реакциях расщепления полиС, и 4 мутантными белками показало, что замена i на приводит к потере активности фермента в 4раза на всех используемых субстратах. Было показано, что вклад i9 в катализ снижается с понижением рКа уходящей группы рКа . С и и рКа 7. Полученные данные указывают, что роль i9 РНКазы А в расщеплении фосфодиэфирной связи РНК состоит в протонировании 5 кислородного атома уходящей группы. В то же время данных, доказывающих что i выступает в качестве основания, получено не было. Авторами работы была предпринята попытка получить соответствующие экспериментальные данные, используя в качестве субстрата 2дезокси2тиорА рКан 8. Ка2он . Полученные значения км, и киКт для расщепления 2дезокси2тиоирА оказались в 5 раз ниже, чем для реакции расщепления . Имеющиеся на сегодняшний день данные не позволяют объяснить наблюдаемый эффект. Однако, учитывая, что i9 выступает в качестве кислоты, разумно предположить, что i участвует в реакции в качестве основания. Ещ одним свидетельством в пользу предлагаемого кислотноосновного механизма могут служить следующие расчеты. Кан 5. КаН1в9 6. Канз 1. КаН2 . Таким образом, усиление основной и кислотной составляющих катализа при замене аланина на гистидин составляет 7 и 9 5а раз, соответственно . Если учесть, что а и Р равны примерно 0. Ранее при изучении вклада аминокислот в функциональную активность белка с помощью химической модификации, предположили, что участвует в катализе . Однако, в более поздних работах . Аналогичный результат был получен при расщеплении РНК ферментом с мутацией . Поскольку изменение эффективности действия фермента слабо зависит от присутствия или отсутствия А1а заряда бокового радикала аминокислоты в положении, полученные результаты позволяют утверждать, что не участвует в самом акте катализа, но эта аминокислота значительно повышает его эффективность.