Исследование лиганд-связывающих участков рецепторов нейротрансмиттеров с помощью природных и химически модифицированных нейропептидов и нейротоксинов

• Автор: Кашеверов, Игорь Евгеньевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 170 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
РАЗДЕЛ 1. ПРИРОДНЫЕ аКОНОТОКСИНЫ И ИХ СИНТЕТИЧЕСКИЕ АНАЛОГИ В ИССЛЕДОВАНИИ НИ КОТ И НОВЫХ АЦЕТИЛХОЛИ НОВЫХ РЕЦЕПТОРОВ. Литературный обзор.
Введение

Глава 1. Химическое строение, пространственная организация и специфичность

действия аконотоксинов .

Глава 2. Области взаимодействия аконотоксинов и нАХР

1 2 1 Синтетические аналоги аконотоксинов.

1 2 2 Мутации в нАХР и парные мутации в аконотоксинах и нАХР

1 2 3 Модели комплексов аконотоксинов с нАХР, построенные на основе

пространственной структуры ацетилхолинсвязывающего белка.
РАЗДЕЛ 2. ИССЛЕДОВАНИЕ ЛИГАНДСВЯЗЫВАЮЩИХ УЧАСТКОВ РЕЦЕПТОРОВ НЕЙРОТРАНСМИТТЕРОВ С ПОМОЩЬЮ ПРИРОДНЫХ И ХИМИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ НЕЙРОПЕПТИДОВ И НЕЙРОТОКСИНОВ. Результа гы работы и их обсуждение.
Введение . .
Глава 1. Получение биотинилированных и фотоактивируемых аналогов вещества Р и изучение их взаимодействия с нейрокининовыми и никотиновыми
ацетилхолиновыми рецепторами .
2 1 1 Метод обнаружения рецептора вещества Р на основе биотинстрептавидиновой
системы
2 1 2 Исследование взаимодействия рецептора вещества Р с антителами к его
синтетическим фрагментам и к веществу Р . . .
2 1 3 Тестирование рецептора вещества Р с использованием радиоактивной формы его низкомолекулярного антагониста .
2 1 4 Анализ взаимодействия рецептора вещества Р с токсическими
компонентами ядов змей. .
2 1 5 Получение и характеристика фотоактивируемых производных вещества Р с
метками в концевой части молекулы
2 1 6 Заключение. .
Глава 2 Синтез новых фотоактивируемых производных анеиротоксинов из ядов
2 2 1 Получение и характеристика бензофеноновых производных ШII . .
2 2 2 Изучение зависимости параметров мечения нАХР Т i фотопроизводными нейротоксина от химической природы введенной фогогруппы
2 2 3 Заключение.
Глава 3 Получение природных и модифицированных аконотоксинов и изучение
их связывания с нАХР Т i . . . .
2 З I Твердофазный пептидный синтез аконотоксииов.
2 3 2 Получение и характеристика радиоактивных производных аконотоксинов
2 3 3 Получение фотоактивируемых анало ов акоиотоксинов 1 и М и их
взаимодействие с нАХР Г i
2 3 4 Локализация фрагментов нАХР Т i, взаимодействующих с
радиоактивным фотоактивируемым аналогом схконотоксина I
2 3 5 Изучение влияния заряженных аминокислотных остатков в аконотоксинах
мышечного типа на сродство к нАХР Т i . .
Глава 4 Синтез природных и модифицированных аконотоксииов, взаимодействующих с нейрональными а7 нинотиновыми
ацетилхолиновыми рецепторами
2 4 1 Получение гетерологически экспрессированных в Е i внеклеточных
доменов а7 нАХР крысы и характеристика их физикохимических и
связывающих свойств . .
2 4 2 Оценка роли отдельных элементов акоиотоксинов 1 и I, определяющих
их специфичность .
2 4 3 Синтез аналогов аконотоксина I и характеристика их действия на
полноразмерных а7 холинорецепторах .
2 Заключение . .
Глава 5 Взаимодействие аконотоксинов с ацетилхолинсвязывающими белками. 3 Глава 6 Рентгеноструктурный анализ комплекса аконотоксина
,I с АХСБ с разрешением 2 4 А . .
Глава 7 Моделирование пространственных структур комплексов аконотоксииов и анейротоксинов с различными типами
холииорецепторов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Основные выводы и перспективы.
РАЗДЕЛ 3. Экспериментальная часть.
ЗЛ. Материалы.
1 Реактивы .
3 1 2 Пептиды, токсины, ферменты
3 1 3 Биологические материалы.
3 Расходные материалы .
3.2. Методы.
1 Твердофазный синтез пептидов . .
3 2 2 Получение аналогов вещества Р, анейротоксинов из яда змей и
аконотоксинов .
3 2 3 Получение радиоактивных соединений
3 2 4 Получение конъюгатов на основе полимерной пероксидазы.
3 2 5 Тестирование рецептора вещества Р крысы на основе биотин
стрептавиди новой системы . . .
3 2 6 Получение поликлональных антител и их очистка
3 2 7 Взаимодействие антител с рецептором вещества Р крысы .
3 2 8 Синтез аффинных сорбентов
3 2 9 Аффинная очистка рецептора вещества Р крысы . .
3 2 Очистка токсических компонентов ядов змеи и их взаимодействие с
рецептором вещества Р крысы
3 2 Выделение, характеристика и рсиатурация субъединиц нАХР Т ii
3 2 Получение внеклеточных доменов а7 нАХР крысы и их характериеггика
3 2 Радиолигандный анализ . .
3 2 Метод изотермической титрующей калориметрии . .
3 2 Электрофизиологические эксперименты . . . .
3 2 Подбор условий фотоактивации для различных фотоакт и ви руемых
лшандов . .
3 2 Эксперименты по фотомечению.
3 2 Локализация фрагментов субъединиц нАХР, меченных 2Вра,
методами ферментативного протеолиза.
3 2 Ыконцевое сиквенирование. .
3 2 Кристаллография и рентгеноструктурный анализ. . .
3 2 Компьюерное моделирование.
ВЫВОДЫ .
Благодарности
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Ринкполимер ,4диметоксифенилРшосаминометилфеноксиполимер ВюВгепе ПЗДибромпропанЫЫтетраметилгексаметилендиамин полимер V8 протсаза эндонротеиназа из ЕС 3. Н эндоу5Лацетилглюкозамидаза Н из i ЕС 3 2 I пептидацетилглюкозаминиласпарагин амидазы из vi i ЕС 3 5. Актуальность проблемы. Изучение на молекулярном уровне функционирования центральной нервной системы млекопитающих и механизмов протекающих в ней разнообразных процессов, среди которых передача нервного импульса один из важнейших, является основной задачей нсирохимии и нейробиологии Главную роль в этих процессах играют неирорецепторы, нарушение работы которых приводит к различного рода тяжелым нейродегенеративным заболеваниям. Оба этих направления в полной мере применимы к присутствующим в ЦС нейрокининовой и холинергической рецепторным системам. Паркинсона, Альцгеймера, шизофрения с тем или иным нарушением в функционировании разных подтипов нАХР, что вызывает в свою очередь необходимость надежной детекции этих подтипов в мозге. Мощным стимулом в выяснении структурнофункциональной организации холинорецепторов стало выделение и установление кристаллической структуры одного из ацетилхолинсвязывающих белков АХСБ, пространственных гомологов экстрацеллюлярных доменов всех нАХР Использование этих водорастворимых белков вместе с набором новых синтезированных холинергических лигандов для получения кристаллических структур их комплексов является исключительно актуальной не только научной, но и практической задачей На основе таких данных методами компьютерного моделирования можно с высокой достоверностью реконструировать детальную структуру лигандсвязывающих участков природных нАХР и создавать их новые более эффективные и селективные лиганды. Цель и задачи исследования. Целью работы была структурнофункциональная характеристика лигандсвязывающих участков нейротрансмиттерных рецепторов с использованием их природных и модифицированных лигандов. Научная новизна и практическая ценность работы. Получены генноинженерные конструкции для различных вариантов экстрацеллюлярных доменов холинорецеп юров, проведена бактериальная экспрессия и получены белки, сохранившие ряд фармакологических свойств полноразмерных нАХР. Апробация полученных результатов. Москва, С Петербург, , 8м Швейцарском семинаре по методологии в рецепторных исследованиях Моршах, Швейцария, , ХШм и ХУм Международных съездах по животным, растительным и микробным токсинам Париж, , Глазго, Шотландия, , м Европейском пептидном симпозиуме Сорренто, Италия, XI и ХНм Международных симпозиумах по холинергическим механизмам С. Публикации по геме работы. Личный вклад автора. Структура и объем диссертации. РАЗДЕЛ 1. Введение. АХР представляют собой обширное семейство лигандуправляемых или нейрогрансмиттеруиравлясмых ионных каналов, которые подразделяют на две основные группы рецепторы мышечного и нейронального типов см. Нейрональные нАХР состоят из комбинаций субъединиц двух типов а а2а и р Р2Р4 Существуют как гетеромерные нейрональные рецепторы например, широко представленные в мозге схЗр2нАХР аЗр2 обозначает, что пентамер рецептора состоит из схЗ и р2субъсдиниц, стехиомефия которых обычно не известна, так и гомоолигомериые, построенные из субъединиц одного типа Например, нАХР, состоящие их пяти сх7субъединиц, являются основным типом нАХР, представленным в гиппокампе В отличие от мышечных постсинаптических рецепторов нейрональные нАХР могут находиться как в пост, так и в иресинаптических областях, в последнем случае они играют важную роль в регуляции высвобождения различных нейротрансмиттеров. Различные нАХР участвуют во многих физиологических процессах, и нарушения их функций могут быть причиной или следствием ряда заболеваний Например, мутации в мышечных нАХР иили образование против них аутоантител являются причиной мышечных дистрофии миастении 7 Мутации в нейрональной а4субъединице связаны с одним из видов эпилепсии 8 Нарушения в уровне различных нейрональных нАХР отмечались при шизофрении, а также при болезнях Альцгеймера и Паркинсона 9. Таким образом, вполне очевидна необходимость в методах четкой идентификации и количественного определения различных подтипов нАХР.