Идентификация и изучение функциональных особенностей новой теломеразы дрожжей

• Автор: Смекалова, Елена Михайловна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

Список сокращений
1. Обзор литературы.
Теломеразная РНК: структура, функции и биогенез
1.1. Реакционный цикл теломеразы
1.2. Структура теломеразной РНК
1.2.1. Псевдоузел
1.2.2. STE элемент
1.2.3. Н/АСА scaRNA домен
1.3. Биогенез теломеразной РНК
1.3.1. Транскрипция и процессинг
1.3.1.1. в дрожжах
1.3.1.2. в реснитчатых простейших
1.3.1.3. в позвоночных (human)
1.3.2. Локализация и траспорт теломеразной РНК
1.3.2.1. в дрожжах
1.3.2.2. в позвоночных
1.4. Взаимодействие теломеразной PIIK с дополнительными белками
1.4.1. в дрожжах
1.4.2. в позвоночных
1.5. Регуляция экспрессии теломеразной РНК человека
1.5.1. Амплификация гена
1.5.2. Регуляция транскрипции
1.5.3. Регуляция с помощью сигнальных путей
1.5.4. Регуляция с помощью механизмов эпигенетики
1.6. Неканонические функции теломеразной РНК
1.7. Заключение

2. Результаты и обсуждение.

2.1. Каталитическая субъединица теломеразы Я. polymorpha
2.1.1. Идентификация каталитической субъединицы
теломеразы Я. polymorpha (hpTERT)
2.1.2. Разработка метода выделения белка hpTERT,
пригодного для структурных и функциональных исследований
2.1.3. Каталитическая субъединица теломеразы Я. polymorpha. экспрессированная в E. coli, обладает ограниченной обратно-транскриптазной активностью в отсутствии теломеразной РНК
2.1.4. Димеризация N-концевого домена hpTERT и белка Est3
дрожжей S. cerevisiae
2.2. ТеломеразаЯ. polymorpha
2.2.1. Детекция теломеразной активности в клетках Я .polymorpha
2.2.2. Характеристики теломеразы Я. polymorpha
2.2.2.1. Способность использовать олигонуклеотиды разной длины
2.2.2.2. Процессивность
2.2.23. Влияние температуры на теломеразную активность
2.3. Теломеразная РНК Я. polymorpha
2.3.1. Выявление кандидатов на роль теломеразной РНК
биоинформатическими методами
2.3.2. Выявление кандидатов на роль теломеразной РНК
биохимическими методами
2.3.3. Транскрипция гена - кандидата на роль теломеразной РНК в клетке
2.3.4. Нокаут гена hpTER приводит к фенотипу укорачивающихся теломер
2.3.5. Предсказание вторичной структуры гена hpTER
2.3.6. Мутационный анализ матричного участка
теломеразной РНК Я. polymorpha
2.4. Теломераза Я. polymorpha использует дополнительный (нетеломерный) нуклеотид А170 с 5’ конца матричного участка
в реакции обратной транскрипции in vitro

2.5. Заключение

3. Материалы и методы
3.1. Реактивы, биопрепараты, буферные растворы
3.2. Методики, использованные в работе
3.2.1. Определение концентрации ДНК в растворе
3.2.2. Клонирование гена hpTERT в вектор pUC19 из генома Н. polymorpha
3.2.3. Клонирование гена hpTERT в различные экспрессионные системы
3.2.4. Выделение и очистка рекомбинантного hpTERT
3.2.5. Проверка функциональности очищенного hpTERT в системе in vitro
3.2.6. Клонирование N-домена hpTERT в вектор pET30aTEV
3.2.7. Получение поликлональных антител против белка hpTERT
3.2.7.1. Выработка иммунного ответа у кролика
3.2.7.2. Проверка специфичности и эффективности связывания
антител с целевым белком методом Вестерн-блот
3.2.8. Выделение теломеразы из клеток Н. polymorpha
3.2.8.1. Наращивание клеток и получение S100 экстракта
3.2.8.2. Определение суммарной концентрации белка в экстракте
с помощью измерения оптической плотности при 235 и 280 нм
3.2.8.3. Хроматография
3.2.9. Детекция теломеразной активности в системе in vitro
3.2.10. Выделение геномной ДНК Н. polymorpha
3.2.11. Клонирование области генома Н. polymorpha,
содержащей ген hpTER в вектор pUC 19_hpTER
3.2.12. Клонирование гена hpTER в шаттл вектор рКАМ556
3.2.13. Мутагенез
3.2.14. Нозсрн-блот анализ
3.2.15. Трансформация дрожжей Я. polymorpha
3.2.16. Анализ фенотипа полученных штаммов методом разбавлений
3.2.17. Анализ фенотипа полученных штаммов методом Саузерн блот
3.2.17.1. Перенос ДНК на нитроцеллюлозиую мембрану
3.2.17.2. Приготовление зондов

В данной работе мы впервые обратились к термотолсрантным дрожжам Натепи1а ро1утогрка (альтернативное название - Р'юЫа а^ш1а) в качестве модели для исследования теломеразы. Этот организм способен выживать при температурах до 50 °С [113]. Н. ро1утогрИа принадлежит к метилотрофным дрожжам, таксономический анализ относит ее к семейству Saccharomycetaceae. Недавно был опубликован митохондриальный геном Н. ро1утогрка, штамм НЬ1. Его состав и расположение генов выявили филогенетическую связь между Я. ро1утогр1га и ВгеИапотусея си.ч1ег,ч1апш'. Эти данные позволяют сомневаться в принадлежности Я. ро1утогрка к роду РкЫа и предполагают создание отдельного рода для данного организма [114].
Известно, что тело меры Н. рсЛутогрИа состоят из 18-23 повторов последовательности 5 ’-ОСС'ЮССС-З ’. Они характеризуются высоким
процентным содержанием О-С пар (87%), а также гомогенностью, необычной для большинства дрожжей . Тот факт, что Я. ро/утогрка стоит на пересечении между разными видами дрожжей делает особенно интересной идентификацию теломеразной РНК из этого организма [115,116].
В промышленности И. ро1утогрка активно используется как организм для производства рекомбинантных белков и вакцин. Одно из преимуществ данной системы - возможность эффективной рекомбинации между трансфецируемой плазмидой и хромосомой. В некоторых случаях такая рекомбинация происходит многократно в области теломер, что повышает выход рекомбинантного белка [117]. Определение компонентов теломеразного комплекса, влияющих на длину теломер, впоследствии может служить инструментом для увеличения эффективности систем для производства ферментов.
Данная работа посвящена идентификации и изучению особенностей теломеразы в термотолерантных дрожжах Натетйа ро/утогрка. Мы ставили следующие задачи:
1. идентификация основных компонентов теломеразы дрожжей Я. ро1утогрка;
2. разработка метода выделения каталитической субъединицы теломеразы, пригодной для структурно-функционального изучения комплекса;
3. изучение особенностей функционирования новой теломеразы дрожжей.