Структурно-функциональное исследование транспортно-матричной РНК Escherichia coli

• Автор: Иванов, Павел Валерьевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 120 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ.

1. СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

2. ВВЕДЕНИЕ.

3. Терминация трансляции и процессы, конкурирующие с ней Обзор литературы

3.1.Терминация трансляции

3.1.1. Историческая справка.

3.1.2. Терминация трансляции. Общие сведения

3.1.3. Декодирующие факторы терминации.

3.1.4. Концепция молекулярной мимикрии.

3.1.4.1. Предполагаемая антикодоновая мимикрия.

3.1.5. Освобождение синтезированного полипептида с помощью факторов

терминации
3.1.6. Диссоциация посттерминационного комплекса
3.1.7. Диссоциация рибосом на субчастицы для последующих раундов
трансляции
3.2.Процессы, конкурирующие с терминацией трансляции
3.2.1. Рекодирование стопкодонов
3.2.1.1. Программированный трансляционный сдвиг рамки считывания и
программированное прочтение стопкодонов.
Щ 3.2.1.2. Рекодирование стопкодона гена бактериофага Т4 i
i.
3.2.1.3.Включение селеноцистеина на стопкодоне
3.2.2. Конкуренция между терминацией трансляции и тмРНК
3.2.3.Конкуренция между терминацией трансляции и бактериальным токсином
3.2.4.Триптофан как эффективный ингибитор терминации трансляции
3.2.5. Деградация мРНК, содержащих преждевременный столкодон i в клетках эукариот
4. Результаты и Обсуждение
4.1. Неканонический комплекс мехщу тмРНК и .
4.2. Модель взаимодействия тмРНК с рибосомой.
4.3. Поиск элемента тмРНК, обеспечивающего узнавание А участком рибосомы
4.4. Исследование роли некоторых консервативных нуклеотидов тмРНК
4.5. Поиск интрамолекулярных супрессоров для летальных мутаций и .
4.6. Мутации нуклеотидов тРНКподобной части, затрагивающие активность
4.7. Разработка метода выделения комплекса транспортноматричной РНК с рибосомой
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
5.1. Реактивы, буферы и растворы.
5.2. Биопрепараты
5.3.Трансформация клеток ii i
5.3.1. Приготовление компетентных клеток для трансформации с помощью теплового шока.
5.3.2. Приготовление компетентных клеток для электротрансформации
5.4. Трансформация.
5.4.1. Электротрансформация клеток Е i.
5.4.2. Трансформация с помощью теплового шока.
5.5. Клонирование гена, кодирующего тмРНК
5.6. Создание генетической системы.
5.7. Конструирование плазмиды .
5.8. Введение мутаций в ген, кодирующий тмРНК
5.8.1. Сайтнаправленный мутагенез
5.8.2. Случайный мутагенез тмРНК i viv и анализ мутантов
5.9. Определение первичной структуры ДНК по Сэнгеру
5 Анализ активности мутантных молекул тмРНК
. Анализ активности мутантных молекул тмРНК с помощью генетической системы.
. Определение активности молекул тмРНК с помощью гибридного фага МттР.
. Аминоацилирование тмРНК.
5 Получение экстракта
5 Выделение комплекса тмРНК, взаимодействующей с рибосомой.
. Выделение комплекса тмРНК, взаимодействующей с рибосомой
. Выделение суммарной РНК комплекса.
. Выделение суммарных белков комплекса
5 Фотоаффинное химическое сшивание тмРНК.
. Синтез тмРНК с помощью Т7РНКполимеразы
. Синтез 4тиоуридин содержащей тмРНК с помощью Т7РНК
полимеразы.
. Фотоаффинное химическое сшивание тмРНК с фактором элонгации Ти или с Б0 экстрактом
. Внутримолекулярное фотоаффинное химическое сшивание тмРНК
5 Анализ продуктов сшивания
. Анализ белкового компонента сшивки.
. Анализ продуктов сшивания с помощью реакции обратной транскрипции .
. Гидролиз тмРНК с помощью РНКазы Н
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Механизм узнавания стопкодонов и собственоо терминации трансляции долгое время оставался непонятным. Впервые в году было показано, что освобождение синтезированнного полипептида из рибосомы происходит не с помощью определенной терминирующей тРНК, а требует участия кодонспецифичных декодирующих белковых факторов, названных позднее факторами терминации. В бактериях стопкодоны узнаются специфическими белковыми факторами названными позднее факторами терминации трансляции I класса 7, один из которых имеет специфичность к и 1, а второй к и 2 8. Позднее был обнаружен третий фактор терминации 3 9,, который не имел специфичности к какомулибо кодону, но стимулировал активность факторов 1 и 2 i vi. Терминация трансляции. Общие сведения. Терминация трансляции финальная стадия биосинтеза белка происходит в три этапа 1 освобождение новосинтезированного белка в ответ на появление стопсигнала в А участке рибосомы, 2 диссоциация факторов терминации из посттерминационного комплекса, и 3 диссоциация рибосомы на субчастицы для последующего раунда трансляции. Эти три этапа терминации очень четко разделены между собой по времени и вызваны различными неродственными белковыми факторами. Узнавание стопсигнала осуществляют факторы терминации I класса т. Большинство эубактериий имеют два декодирующих фактора терминации 1 и 2, в то время как в клетках эукариот присутствует только один фактор терминации I класса 1. Декодирующие факторы стимулируют гидролиз пептидилтРНК и таким образом освобождают новосинтезированный полипептид. В клетках также присутствуют факторы терминации II класса 3 у эубактерий и 3 у эукариот, субстратом для которых является лосттерминационный комплекс. Задачей данных факторов является удаление декодирующих факторов терминации из рибосомы. После этого рибосома должна диссоциировать на субчастицы для инициации следующего раунда трансляции. В клетках бактерий данная стадия протекает с помощью специального фактора, называемого i i , однако у эукариот данного фактора не обнаружено, и диссоциация рибосомы на субчастицы, повидимому, происходит с помощью другого механизма. Декодирование стопсигнала на мРНК может быть, в принципе, осуществлено i самой рибосомой ii внешними трансфакторами, которые ассоциируют с рибосомой в ответ на присутствие стопсигнала в ее А участке и затем диссоциируют после завершения своей задачи и iii комбинированным действием рибосомы и внешних трансфакторов. Существует предположение, что рРНК как малой, так и большой субчастицы рибосомы могут напрямую взаимодействовать со стопкодоном мРНК ,1, что подтверждается результатами нескольких экспериментов. Вопервых, мутации в рРНК большой и малой субчастиц сильно влияют на эффективность терминации трансляции ,. Вовторых, стопкодон находится в тесном контакте с рибосомной РНК в рибосоме . Втретьих, два сегмента прокариотической рРНК спирали и могут быть свернуты в тРНКподобную структуру с антикодонлодобными петлями, комплементарным стопкодонам . Однако последняя гипотеза, выдвинутая на основе подходов биоинформатики, противоречит данным рентгеноструктурного анализа . В литературе описаны данные, свидетельствующие в пользу прямого взаимодействия между стопкодонами и декодирующими факторами терминации . Например, с помощью метода химического сшивания было показано, что факторы терминации специфически взаимодействуют со стопкодонами, хотя и с достаточно низким выходом , . Мутации в бактериальных факторах терминации , факторах терминации дрожжей и человека , 1 влияют на узнавание стопкодона. Факт существования внешних факторов и их участие в терминации трансляции в кодонспецифической манере не дает ответа на вопрос, узнаются ли стопкодоны посредством прямого взаимодействия с ними вторая гипотеза или это происходит при посредничестве рРНК третья гипотеза. Известно, что на стадии элонгации трансляции существует временное сильное взаимодействие между кодонантикодоновым дуплексом в А участке и нуклеотидами рРНК в особенности с нуклеотидами 0, А и А в малой субчастице рибосомы . Сходные данные существуют и для рРНК .