Структуры некоторых мутантных генов rpoB, кодирующих бета-субъединицу РНК-полимеразы Escherichia coli

• Автор: Лисицын, Николай Александрович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1985
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 127 c. : ил

ГЛАВА I. СТРУКТУРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

(ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР)

I. Структурно-генетический подход.Краткие

сведения

П. Структурно-генетические исследования

гроВС оперона Escherichia coli

A. Локализация и исследование организации

гроВС оперона

B. Исследование взаимодействия РНК-полимеразы E. coli с антибиотиками и вирусными белками, инактивирующими фермент

1. Взаимодействие с рифампицином

2. Взаимодействие со стрептолидигином

3. Взаимодействие с липиармицином и
тиолутином
4. Взаимодействие с белком гена 2 бактериофага Т7
C. Структурно-генетические исследования взаимодействия РНК-полимеразы E.coli с компонентами реакции транскрипции на разных
этапах процесса in vitro
1. Основные этапы процесса транскрипции.
Краткие сведения
2. Е1сследование взаимодействия РНК-полимеразы с промоторами
3. Структурно-генетические исследования процессов инициации и элонгации транскрипции

4. Структурно-генетические ’исследования процесса терминации транскрипции
5. Структурно-генетические исследования механизмов регуляции транскрипции
A. Взаимодействие РНК-полимеразы с белками-регуляторами
B. Координация процессов транскрипции и
трансляции
C. Координация процессов транскрипции и
репликации
Глава II. СТРУКТУРА НЕКОТОРЫХ МУТАНТНЫХ ГЕНОВ гроВ,
ESCHERICHIA COLI, КОДЙРУЩИХ J3 -СУБЪЕДИНИЦУ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ (ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ)
A. Получение и селекция мутаций устойчивости РНК-полимеразы E.coli к антибиотикам риф-ампицину и стрептолидигину в составе гена
гроВ
B. Препаративное выделение фрагментов гена
гроВ мутантного типа
C. Установление первичной структуры фрагментов гена гроВ мутантного типа
1) Определение первичной структуры EcoRl-C фрагментов гена гроВ, несущих мутации гроВ1001 , гроВ101б и гроВ1017
2) Установление первичной структуры EcoRI-G фрагмента, несущего мутацию гроВ1019
8) Определение первичной структуры .EcoRI-C фрагмента гена гроВ, несущего stl-r мутацию гроВЮ18
Д. Локализация мутаций. Анализ характера
локализованных замен

1) Локализация и анализ расположения и характера мутаций рифампицин-устойчивости
2) Локализация мутации устойчивости РНК-полимеразы к антибиотику стрептождигину
Е. Локализация функционально важных участков
в составе р -субъединицы РНК-полимеразы
E.coli
Глава III. ЭКСПЕРШЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
I. Материалы
A. Реактивы
B. Ферменты
C. Генетические материалы
Д. Растворы
1. Буферные растворы
2. Среды и сопутствущие растворы
3. Растворы для выделения плазмид
4. Растворы с красителями
5. Растворы для проведения химической модификации
6. Растворы для метода терминирующих
аналогов трифосфатов
7. Смеси для приготовления ПААТ
8. Фотографические растворы и материалы
П. Оборудование
Ш. Методы
I) Приготовление гелей. Электрофорез
A. Заливка ПААТ. Условия электрофореза в ПААТ
B. Приготовление агарозных гелей. Условия электрофореза
2) Выращивание клеток рекомбинантных штаммов
3) Выделение плазмидной ДНК

дочищать непродолжительным высокоскоростным центрифугированием в растворе хлористого лития /108/.
Для выделения фрагментов ДНК из рекомбинантной плазмиды последнюю гидролизовали эндонуклеазой рестрикции ЕооШ: и отделяли выщепляемый фрагмент от линейной формы плазмиды препаративным электрофорезом в блоках агарозы с последующей электроэлюцией (электроэлюцию следует проводить при низкой напряженности ПОЛЯ с целью уменьшения количества примесей, содержащихся в агарозе). Затем препарат дважды экстрагировали фенолом и высаживали спиртом.
Описанными методами удается выделить 1-2 мг плазмиды из 2 литров культуры, что позволяет получить 100-200 мкг очищенного препарата фрагмента ДНК мутантного типа, пригодного для целей структурного анализа.
С. Установление первичной структуры фрагментов гена гроВ мутантного типа
Установление последовательности ДНК методом Максама-Гилбер-та, в основном использовавшегося в данной работе, включает ряд этапов:
1. Гидролиз фрагмента ДНК подобранной рестриктазой (полнота гидролиза контролируется электрофорезом аликвоты в ПААТ).
2. Введение концевой радиоактивной метки с помощью полинук-леотидкиназы бактериофага Т4 или фрагмента Кленова ДНК-полимера-зы I (полнота реакции контролируется отмывкой аликвоты от непрореагировавшего радиоактивного предшественника с последующей регистрацией включенной радиоактивности).
3. Разделение меченых субфрагментов в ПААТ с последующей элюцией.
4. Получение полинуклеотидов, меченных по одному концу,эле-