Роль элементов 23S pРНК в формировании сайтов связывания тРНК на рибосоме Escherichia coli и в процессе транслокации

• Автор: Лесняк, Дмитрий Витальевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура частиц ii сои.

1.2. Связывание тРНК с рибосомой.

1.3. Расположение молекул тРНК в различных функциональных состояниях рибосомы

1.3.1. АТ положение тРНК.

1.3.2. АА положение тРНК.

1.3.3. РР положение тРНК па рибосоме.

1.3.4. ЕЕположение тРНК на рибосоме.

1.4. Изменение конформации тРНК во время элонгационного цикла

1.5. Гибридные сайты связывания тРНК.

1.6. Исследования динамики тРНК на рибосомах методом флуоресцентного резонансного переноса энергии.
1.7. Структура рибосомы при гибридном положении тРНК.
1.8. Эволюция представлений о структуре и функции Есайта
1.9. Обратная транслокация тРНК
1. Заключение
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Реактивы, буферы и растворы.
2.2. Трансформация клеток ii сои
2.3. Мутагенез методом Кункеля
2.4. Клонирование части гена рРНК в плазмиде I
2.5. Выделение рибосом из штамма V9 Е.сои.
2.6. Аффинное выделение рибосомных субчастиц с использованием аптамера
к стрептавидину.
2.7. Аффинное выделение факторов трансляции, аминоацилтРНКсинтетаз и белка .
2.8. Получение препаратов аминоацилтРНК
2.9.Эффективность полии зависимого синтеза полиРне
2 Получение мРНК.5
2 Формирование функциональных комплексов тРНК с рибосомой.
2 Реакции тоупринтинга
2 Тестирование СТРазной активности , индуцированной различными рибосомными комплексами.
2 Химический пробинг структуры рибосом .i и их комплексов с тРНК
. Реакции модификации.
. Выделение суммарнойрибосомной РНК после модификации.
. Реакция обратной транскрипции.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Исследование Есайта на большой субчастице.
3.1.1. Связывание тРНК с нарушенным Есайтом
3.1.2. Влияние нарушения связывания тРНК с Есайтом па элоигационный цикл.
3.1.3. Влияние нарушения формирования гибридных сайтов, вызванное мутацией , на функционирование
3.1.4. Проверка влияния мутации на частоту ошибок трансляции i viv.
3.2. Изучение структурнофункциональной роли нуклеотида рРНК
3.2.1. Изучение связывания тРНКрибосомами, несущими мутацию
3.2.2. Тестирование пептидилтрансферазпой реакции рибосом
3.2.3. Исследование структуры комплексов рибосом, несущих мутацию с тРНК в А и сайтах с помощью химической модификации.
3.2.4. Создание пошаговой системы для определения эффективности отдельных этапов цикла трансляции i vi
3.2.5. Изучение влияние мутации на функционирование фактора модуляции рибосом.
3.2.6. Мутация и ее летальный фенотип.
4. ВЫВОДЫ
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
Список сокращений
А аденин или остаток адениловой кислоты
АТР аденозинтрифосфорная кислота
С цитозин или остаток цитидиловой кислоты
2дезоксирнбонуклеозид5трифосфаты А, Т, , С
гуанин или остаток гуанидиловой кислоты
гуанозинтрифосфорная кислота
I изопропилтногалактопиранозид
рибонуклеозидтрифосфаты А, Т, , С
i додецил сульфат натрия
Т тимин или остаток тимидиловой кислоты
i трисоксиметиламинометан
урацил или остаток уридиловой кислоты
ДНК 2дезоксирибонуклеиновая кислота
КриоЭМ криоэлектронная микроскопия
мРНК матричная РНК
полии полиуридиловая кислота
ПЦР полимеразная цепная реакция
РНК рибонуклеиновая кислота
рРНК рибосомиая РНК
РСА реитгеноструктурный анализ
ТЕМЕД , , , ,тетр а м ети л эти л е н д и ам и н
ТХУ трихлоруксусная кислота
ЭДТА этилендиаминтетраацетат натрия
Введение


Это активный, динамичный процесс, для понимания которого мало знать атомарную структуру рибосомы и ее комплексов с мРНК и тРНК. Необходимы глубокие структурнофункциональные исследования, воспроизведение промежуточных стадий процесса i vi и их изучение, выяснение роли отдельных элементов всего молекулярного ансамбля в транслокации. В настоящей работе мы изучали свойства Есайта рибосомы с помощью сайтнаправленного мутагенеза, а также выясняли роль малоизученного участка пептидилтрансферазного центра в цикле трансляции. Нами были сделаны две точечные замены в рибосомной РНК, которые оказали серьезное влияние на жизнеспособность мутантных штаммов ii i. Мутации были нацелены на заранее определенные этапы процесса транслокации. Одна из введенных мутаций привела к сильному снижению жизнеспособности клеток, вторая оказалась летальной. Работа посвящена изучению отдельных стадий функционирования рибосомы, которые оказались нарушены в результате данного мутагенеза. Основные эксперименты сделаны i vi на очищенных компонентах аппарата трансляции. РНК и тРНК на рибосоме. Активно растущая прокариотическая клетка до энергии тратит на синтез белка. В этом биохимическом процессе центральное место занимает рибосома сложный рибонуклсопротеидный комплекс. Рибосома осуществляет трансляцию генетического кода именно на ней происходит синтез полипептидных цепей. Биохимические анализы показали, что на массы рибосом составляет II. Некоторое время пытались доказать, что роль рРНК сводится к передаче генетической информации от ДНК, а белки в составе рибосомы играют каталитическую функцию. Однако эта концепция с течением времени встречала все больше противоречий. После выделения и очистки и рРНК . Позднее стали появляться сведения о том, что белки сосредоточены преимущественно на периферии рибосомы, а в центральной ее части РНК. Было обнаружено, что РНК может формировать стабильную вторичную и третичную структуры, то есть, служить каркасом сложных рибонуклеопротеидных частиц. В довершение всего, были открыты рибозимы 1 и обнаружено, что каталитический псптидилтрансфсразный центр практически полностью свободен от белков 2. Вторичная структура рРНК представляет собой многочисленные короткие двойные спираш, перемежающиеся одноцепочечными участками 3. Структура спиралей стабилизируется уотсонкриковскими взаимодействиями комплементарных оснований. Таких небольших спиралей в прокариотической рибосоме насчитывается примерно 0 4. Свернутая подобным образом молекула укладывается в пространстве в глобулярную структуру с плотной упаковкой. РНК, где конформационная подвижность внутри субчастицы менее важна. Глобула 8 рРНК внутри рибосомы выглядит как единый домен. Третичную структуру рРНК могут стабилизировать несколько типов взаимодействий. Вопервых, это магниевые мостики. Это важно там, где фосфаты экспонируют атомы кислорода достаточно близко, чтобы они могли служить лигандами для общего иона магния. Иногда ионы магния могут быть организованы в кластеры по два и три. Другим примером стабилизирующих взаимодействий является образование водородных связей между основаниями, необязательно канонического вида, в результате чего оказываются сближенными отдаленные элементы вторичной структуры. Достаточно часто аденин одной спирали внедряется в малую бороздку другой спирали, где образует водородные связи как с одной или двумя 2ОНгруппами вСпары, так и с основаниями. В большой субчастице Я. Мш таких взаимодействий насчитывается 6, причем из них образованы с участием высококонсервативных остатков аденина. Третьим способом связи между разными спиралями рРНК являются белковые скрепки. Молекула белка, участвующая в такой связи, как правило, имеет несколько глобулярных доменов, каждый из которых может взаимодействовать с рРНК. РНК, со своей стороны, также имеет особые структурные элементы для связи с белками. Одним из примеров может послужить специальный мотив, названный Кповорот 8, с которым взаимодействуют рибосомные белки. В малой субчастице таких мотивов два, в большой шесть. Однако около трети всех белков большой субчастицы, так или иначе взаимодействуют с ними.