Зондирование контактов ДНК-метилтрансфераз EcoRII и SssI с ДНК с помощью фотоактивных аналогов субстрата и молекулярного моделирования

• Автор: Кудан, Елизавета Валерьевна
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 114 с. : ил.

Содержание

Список сокращений

Введение.

Глава 1. С5ДНКметилтрансферазы .II и Ббб

Обзор литературы.

1.1. Общиссвсдсния о прокариотических С5ДНКметилтрансферазах.

1.2. Моделирование С5МТаз по гомологии.

1.3. ДЫКметилтрансфсраза Ббэ

1.3.1. Общие сведения о ферменте

1.3.2. Изучение механизма взаимодействия М.Бяя с ДНК.

1.3.3. Применение М.Бзб в молекулярной биологии

1.4. ДНКмстилтрансфераза ЕсоШ.
1.4.1. Общие сведения о ферменте
1.4.2. Изучение механизма взаимодействия М.ЕсоШ с кофактором.
1.4.3. Изучение механизма взаимодействия М.ЕсоЯ с ДК
1.4.4. М.ЕсоШ как регулятор гена М.ЕсоШ.
1.4.5. Применение М.ЕсоШ в молекулярной биологии.
1.5. Дезаминирование метилируемого остатка цитозина.
Глава 2. Зондирование контактов ДЫКмегилтрансфераз ЕсоЯП
и Ббб с ДНК с помощью фотоактивных аналогов субстрата и молекулярного моделирования Обсуждение результатов
2.1. Зондирование контактов ДНКметилтранефсразы ЕсоШ с ДНК
методом фотоаффинпой модификации
2.1.1. Дизайн аналогов субстрата
2.1.2. Взаимодействие М.ЕсоШ с аналогами субстрата, содержащими
остаток 543трифторметилЗНдиазиринЗилфснил2урацила
2.1.3. Взаимодействие М.ЕсоШ с аналогами субстрата, содержащими
остаток 5иодурацнла
2.1.4. Анализ продуктов ковалентного присоединения М.ЕсоЯИ
к ДНКдуплексам И, УУ1Г
2.2. Моделирование по гомологии ДНКметшпрансферазы ЕсоШ
и ее комплекса с ДНК и АсоНсу
2.2.1. Общая стратегия моделирования
2.2.2. Оценка модели М.ЕсоШ
2.2.3. Описание модели М.ЕсоЯН и ее комплекса с ДНК и АсоНсу.
2.2.4. Предсказанные взаимодействия М.ЕсоЯН с ДИК.
2.2.5. Сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными.
2.3. Моделирование по гомологии ДНКметилтрансфсразы I
и ее комплекса с ДНК и .
2.3.1. Общая стратегия моделирования
2.3.2. Оценка модели .I.
2.3.3. Описание модели . и сс комплекса с ДНК и .
2.3.4. Предсказанные взаимодействия . с ДНК.
2.3.5. Предсказанные взаимодействия .I с аналогом кофактора
2.3.6. Сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными.
2.4. Заключение.
Глава 3. Экспериментальная часть
3.1. Реактивы и материалы.
3.2. Приборы и методы.
3.3. Общие методики.
3.3.1. Ферментативное бфосфорилирование синтетических
олигонуклеотидов
3.3.2. Изучение метилирования модифицированных ДНКдуплсксов .II
3.3.3. Изучение комплексообразования модифицированных
ДНКдуплексов с .I
3.3.4. Ковалентное присоединение модифицированных ДНКдуплсксов
к .II
3.3.5. Картирование конъюгатов .II с модифицированными ДНКдуплсксами химическими реагентами.
3.3.6. Моделирование .II но гомологии
3.3.7. Моделирование .I по гомологии
3.3.8. Оценка стереохимии моделей .II и .I.
3.3.9. Моделирование комплекса .II .I с ДНК и .
Список литературы


Для обеих МТаз данные рентгеноструктуриого анализа РСА отсутствуют, и практически неизвестно, какие аминокислотные остатки ферментов обеспечивают узнавание ДНК и принимают участие в катализе. ДНК или осуществление катализа. Каждая из программ имеет своисильные и слабые стороны. В последнее время в области моделирования белков по гомологии был достигнут значительный прогресс, связанный с созданием и развитием метасерверов, позволяющих получать более точные предсказания за счет комбинирования результатов, полученных несколькими независимыми программами. Модели белков, построенные с использованием мстассрверов, обладают достаточно высоким качеством. На основании модели фермента и его комплекса с ДНК, можно сделать предположение о том, какие аминокислоты участвуют в связывании ДНК и катализе. Целью настоящей работы явилось изучение Д1 Iбелковых контактов в комплексах . II и . I с ДНК и определение функционально значимых областей . II с помощью фотоактивных аналогов субстрата и молекулярного моделирования. В задачи работы входило 1 получение конъюгатов . II с фотоактивными аналогами ДНКсубстрата 2 определение участков . II, к которым происходит ковалентное присоединение фотоактивных ДНКдуилексов 3 моделирование комплексов М. Есо1ШДНКАбоНсу и . М.ЕсоЮ и Мзд, вовлеченных во взаимодействие с ДНК 4
сопоставление результатов моделирования с экспериментальными данными для выявления наиболее вероятных контактов между ферментами и ДИК. ГЛАВА 1. ДНКмстилтрансфераз МТаз, их структуре и механизме специфического взаимодействия с ДНК рассмотрена в обзорах 1 3. В данном разделе суммированы основные сведения о прокариотических С5МТазах. ДНКметилтрансферазы семейство ферментов, катализирующих перенос метилыюй группы от кофактора Яадснозильметионина АсоМе на молекулу ДНК. МТазы сначала связываются с неметилированным ДНКсубстратом и метилируют одну из его цепей, а затем связываются с полуметилированным ДНКсубстратом и метилируют вторую цепь. В процессе реакции АсоМщ превращается в 5аденозильгомоцистеин АсоНсу схема 1
Схема 1. В прокариотах МТазы входят, главным образом, в состав систем рестрикциимодификации, осуществляющих защиту клетки от проникновения чужеродной ДНК 4, 5. Среди прокариотических МТаз можно выделить три основных типа по химической природе осуществляемого ими катализа С5МТазы, катализирующие перенос метильной группы от к атому углерода С5 остатка цитозина. Газы, катализирующие перенос метильной группы на экзоциклическую аминогруппу в случае Ы4метилаз метилируемым основанием является остаток цитозина, а в случае метилаз остаток аденина. В высших организмах МТазы узнают последовательность и метилируют остаток цитозина. Известно, что конденсация хроматина, инактивация Xхромосомы, регуляция транскрипции некоторых генов, а посредством этого и канцерогенез в эукариотах строго контролируются степенью метилирования богатых кластеров в ДНК 1,79. Сравнение аминокислотных последовательностей МТаз выявило гомологию в первичных структурах этих ферментов. К настоящему времени в аминокислотных последовательностях С5МТаз выделено десять консервативных мотивов , . Наиболее консервативными являются мотивы I XX, IV и VI V. Исходя из имеющейся информации о механизме функционировании этих ферментов, сопоставленной с данными РСА, были установлены функции консервативных мотивов. Мотив I входит в состав участка связывания кофактора. Данный мотив присутствует у многих зависимых белков, включая вес ДНК, РНК и некоторые белковые метилтрансферазы , . Мотив IV содержит инвариантный дипептид Рго, участвующий в переносе метильной группы. Замена остатков в данном дипенгиде на другие остатки приводила к потере каталитической активности МТаз II, и НаеШ , , . Высококонсервативный для всех С5МТаз остаток цистеина в составе этого дииептида образует ковалентный интермедиат с метилируемым цитозином в процессе реакции метилирования. Аминокислотные остатки в составе мотива VI принимают участие в структурной перестройке молекулы ДНК в процессе катализа. В связывании кофактора также участвуют аминокислотные остатки из мотивов II, III и X 1,, а в катализе аминокислотные остатки из мотивов VII и VIII.