Структуры хромофоров жёлтого (zFP538) и пурпурного (asFP595) гомологов зелёного флуоресцентного белка (GFP)

• Автор: Захаров, Михаил Владимирович
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 170 с. : ил.

Оглавление
Введение.

Обзор литературы

1. Ковалентные структуры хромофоров цветных гомологов зелного флуоресцентного белка СРР как ключ к происхождению и механизмам эволюции семейства СКР

подобных белков

1.1.Введени е

1.2.Структуры и свойства вРР и его гомологов. Структуры хромофоров вИРподобных белков.
1.3.Спектральные свойства вИРподобных белков, выделяемых из них хромопептидов и синтетических модельных хромофоров

1.4.Некоторые свойства ЛГацилиминов

1.5.Фрагментация полнпептидных цепей желтого и красных гомологов бРР

1.6. Роль отдельных аминокислотных остатков в последовательностях гомологов вРР в формировании их хромофоров и в их спектральных свойствах, выявляемая методами направленного и статистического мутагенеза.
1.7.Структуры хромофоров жлтого гРР8 и пурпурного аРР5 гомологов вРР и возможные механизмы их образования
1.8.Природные нмидазо1,2япиразины, их синтетические аналоги и
вопросы биосинтеза.
1.9.Гипотезы о происхождении и эволюции семейства ОРРподобных белков проблемы и перспективы
1Заключение.
Экспериментальная часть
2. Материалы и методы.
3. Результаты и их обсуждение
3.1. Экспрессия и выделение флуоресцентных белков.
3.2. Денатурация 8, и 5, ферментативный гидролиз белков и выделение хромопептидов7
3.3. Хромофорсодержащие пептиды, выделенные из белка 8
3.3.1. Аминокислотный и масссиектрометрический анализ хромопептидов из 8.
3.3.2. Спектры поглощения и флуоресценции хромопептидов из 8.
3.3.3. Исследования хромопептидов, выделенных из 8, методом спектроскопии ЯМР
3.3.4. Структуры хромофорсодержащих пептидов из 7.8.
3.3.5. Подтверждение структуры хромопептида 8III
3.4. Фрагментация полипептидной цепи 81
3.5. Направленный мутагенез 8 и 6
3.6. Свойства хромопептидов, выделенных из и 5, и их структуры. Фрагментация полипептидной цепи 5.
3.7. Структура хромофора 5.
3.8. Структура хромофора 8
Выводы.
Список сокращений
Благодарности
Список литературы


При переходе от нейтрального хромофора к заряженному хромофору протон гидроксильной группы остатка Туг в положении 2ХОТ перемещается посредством широкой системы водородных связей на карбоксильный кислород остатка 2. Изменение формы А до формы I это только изменение протонированного состояния, тогда как изменение формы I до формы В это уже конформационнос изменение, основные перестановки при котором происходят около остатка 3. Спектральные свойства денатурированного . При низких значениях максимум поглощения наблюдается при 2 нм, при высоких при 7 нм. Переход одной спектральной формы в другую полностью обратим, характеризуется одной четкой изобестической точкой при 5 нм и контролируется группой с рКд 7,9. Примерно такие же спектральные свойства демонстрируют и модельные соединения на основе структуры I И, 3 или ЯСНз, 225. Незначительные различия в максимумах поглощения хромопептидов и модельных соединений, но всей видимости, следует объяснить влиянием на хромофор ионогенных групп аминокислотных остатков, присутствующих в пептидах, но отсутствующих в модельных соединениях. Постулируется, что зависимые спектральные характеристики изолированного хромофора обусловлены ионизацией гидроксильной группы остатка Туг в положении 2ХОТ . Сдвиг рКа в кислую область по сравнению с незамещнными фенолами или фенолами с насыщенными заместителями объясняют влиянием конъюгированной системы I, которая стабилизирует резонанс фенолятаниона и хинона i . Спектр поглощения денатурированного СРР очень сильно зависит от . На поглощение и флуоресценцию нативного СИР изменение окружающей среды в диапазоне от 6,0 до ,0, напротив, не оказывает никакого влияния. Денатурация СИР сопровождается гипсохромным сдвигом максимумов поглощения, характерных для анионной и нейтральной форм хромофора. Этот эффект объясняется нарушением связей хромофора с боковыми цепями аминокислот в нативном белке. В неструктурированном белке вклад таких взаимодействий в общий спектр поглощения ничтожно мал, и спектр поглощения денатурированного белка довольно точно отражает химическую структуру самого хромофора. Исследования зависимости спектров модельного соединения II, ЯСНз, ИСНгССЬСгНз от полярности растворителя показали, что с ее уменьшением положение максимума поглощения, наблюдаемого при высоких , незначительно сдвигается в длинноволновую область, а положение максимума в кислом растворе практически не изменяется i , . Получается, что окружение находящегося в анионной форме хромофора в нативном белке неполярно и больше всего напоминает вакуум, чему есть и экспериментальные подтверждения. Сошлмся на одну из работ , , в которой изучались спектры модельного соединения II, ,3 в сильно разреженной газовой фазе. В этих условиях между полосой поглощения газообразного аниона 9 нм и второй полосой поглощения белка 5 нм наблюдается большое сходство. Конечно, сравнение внутреннего содержания белковой глобулы с вакуумом не следует понимать буквально просто нативный белок какимто образом обеспечивает близкое к вакууму окружение хромофора. Ещ одно примечательное наблюдение над хромопептидами из и над модельными соединениями II с насыщенными заместителями состоит в том, что они не флуоресцируют в водных растворах, а также и в неводных при физиологических температурах. Авторы работы i , сумели добиться детектируемой флуоресценции хромопептида из со структурой V соединение IV, см. II, 3, 22 только в составе льдинки из водноэтанольной смеси при К. Спектры эмиссии анионных форм этих двух соединений были не вполне убедительны странные по форме и с коротко вол новыми максимумами при 5 нм по сравнению с нативным 6 нм. СаСр остатка Туг в положении 2ХОТ. При криогенной температуре изомеризация, вероятно, затормаживается, и флуоресценция становится преобладающим процессом перехода молекулы из возбужденного состояния в основное. Подобное объяснение выглядит вполне убедительно. Насколько нам известно, иных сведений о флуоресценции хромофора вне его нативного окружения в печати не появлялось. На сегодняшний день подавляющее количество генов подобных белков клонировано из морских кишечнополостных, принадлежащих к классу .