Выключение синтеза белка в бактериальной клетке с помощью олигоглутамилирования рибосомного белка S6

• Автор: Нестерчук, Михаил Васильевич
• Шифр специальности: 02.00.10
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 108 с. : ил.

Содержание

Список принятых сокращений

Введение
1. Обзор литературы. Посттрансляцнонныс модификации рнбосомных белков Escherichia coli
Введение

1.1. Процессинг N-копца рнбосомных белков

1.2. Процессинг С-конца белка L

1.3. Метилирование рибосомных белков

1.3.1. Метилирование белка LI

1.3.2. Метилирование белка L

1.3.3. Метилирование белка SI 1 и образование изомерной пептидной связи

1.3.4. Метилирование белка L7/L
1.3.5. Метилирование белков L1 б и L
1.4. Ацетилирование рибосомных белков
1.4.1. Ацетилирование белка S
1.4.2. Ацетилирование белка S
1.4.3. Ацетилирование белка L
1.5. Гидроксилирование белка L1 б
1.6. Мстилтиолирование белка S
1.7. Олигоглутамилирование белка S
Заключение
2. Обсуждение резз'льтатов
Введение
2.1. Зависимость модификации белка S6 от стадии роста бактериальной культуры
2.2. Определение субстратной специфичности фермента RimK
2.3. Влияние олигоглутамилирования белка S6 на процесс трансляции
2.4. Влияние модификации белка S6 на активность рибосом in vitro
2.5. Влияние модификации белка S6 на выживаемость бактериальной культуры в условиях дефицита ресурсов
2.6. Связь модификации белка S6 с образованием спящих бактериальных клеток
Заключение

3. Материалы и методы
3.1. Реактивы и биопрепараты
3.1.1. Реактивы
3.1.2. Буферы и растворы
3.1.3. Штаммы и плазмиды
3.1.4. Олигонуклеотиды
3.2. Методики, использованные в работе
3.2.1. Манипуляции с ДНК
3.2.1.1. Выделение тазмидпой ДИК
3.2.1.2. Определение концентрации ДНК в растворе
3.2.1.3. Рестриктиый анализ тазмидпой ДНК
3.2.1.4. Разделение фрагментов ДНК в агарозном геле
3.2.1.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля
3.2.1.6. Приготовление сектора и вставки
3.2.1 Л. Лигирование
3.2.1.8. ПЦР
3.2.1.9. Мутагенез с помощью набора (ЦискС]шпре (8и-а1арепе)
3.2.1.10. Секвеиироваиие плазмид и ПЦР-продуктов
3.2.1.11. Приготовление компетентных клеток
3.2.1.12. Трансформация компетентных клеток
3.2.2. Получение модельных штаммов АптК-Бб-саI и АптК-Бб-Е^-са!
3.2.2.1. Получение кассеты для трансформации
3.2.2.2. Внесение кассеты в геномную ДНК
3.2.2.1. Анализ полученных клонов
3.2.3. Получение плазмиды для экспрессии гена птК
3.2.4. Работа с клеточными культурами
3.2.4.1. Определение титра клеток
3.2.4.2. Измерение выживаемости теток в стационарной фазе роста
3.2.4.3. Измерение скорости вытеснения клеток АптК клетками дикого типа при совместном культивировании
3.2.4.4. Определение количества спящих клеток (ампицимгшовый тест)
3.2.4.5. Определение количества спящих клеток с помощью проточной цитометрии
3.2.5. Выделение рибосом, белков, клеточных экстрактов
3.2.5.1. Выделение фракции рибосом

3.2.5.2. Выделение суммарного рибосомного белка
3.2.5.3. Белковый электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
3.2.5.4. Иммуиоблоттииг
3.2.5.5. Двумерный дифференциальный гель-электрофорез
3.2.5.6. Окрашивание белковых ПААГ серебром
3.2.5.7. Идентификация белковых зон в ПААГ
3.2.5.8. Меченые флуоресцентной меткой вновь синтезированных белков
3.2.5.9. Выделение рекомбинантного фермента RimK с помощью Ni-NTA агарозы
3.2.5.10. Приготовление клеточного экстракта S
3.2.5.11. In vitro трансляция
3.2.5.12. Проведение модификации белка S6 in vitro
4. Выводы
Список литературы

Белок Ы6 важен в организации структуры аминоацил-тРНК связывающего сайта. Удаление Ы6 негативно сказывается на ряде аспектов работы рибосомы, в том числе на связывание субчастиц друг с другом [55], связывание аминоацил тРНК[56], пептидилтрансферазной активности [57], гидролизе пецтидил тРНК [58].
Фермент УсШ структурно гомологичен человеческим белкам Мта53 и N066, которые катализируют гидроксилирование 1.27а и Ь8, соответственно. Оба этих белка связываются с предшедственниками рибосом и предположительно участвуют в сборке рибосомных частиц [54].
Рисунок 1.17. Смоделированная структура комплекса Ус/О (показан в виде поверхности) с Ь16 (показан в виде лент) [54].
Фермент УсШ модифицирует белок ІЛ6 в свободном состоянии, до его включения в рибосому. Остаток А^81 в структуре несвязанного с рибосомой Ы6 располагается на длинной, гибкой неструктурированной петле, соединяющей соседние Р-ТЯЖИ (смоделированная структура комплекса УсШ с Ы6 показана на рис. 1.17). В структуре рибосомы эта петля имеет фиксированное положение за счёт взаимодействия с 23 Б рРНК. Гидроксиллирование остатка А^81 может обеспечивать образование дополнительной водородной связи, стабилизирующей комплекс Ы6 с 23Б рРНК [54]. В процессе сборки рибосомы белок ІЛ6 встраивается одним из последних [59]. Значит гидроксилирование белка Ы 6, вероятно, играет важную роль в последних этапах сборки рибосомы.