Структура lux-оперонов и механизмы регуляции типа "Quorum Sensing" у морских бактерий

• Автор: Манухов, Илья Владимирович
• Шифр специальности: 03.02.07
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 151 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1. Актуальность темы
2. Цели и задачи
3. Научная новизна
4. Практическая значимость работы
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1. Психрофильные и мезофильные светящиеся морские бактерии.
1.1. Филогения морских светящихся микроорганизмов
1.2. Особенности психрофильных бактерий.
1.3. Перспективы применения психрофильных микроорганизмов в
биотехнологии.
2. Quorum Sensing системы 2.1. LuxI/LuxR-зависимая регуляция биолюминесценции у морских
бактерий A. fischeri ~
2.2. Аутоиндукторы первого типа и их взаимодействие с LuxR-
подобными белками
2.3. Внутриклеточные факторы регуляции экспрессии генов,
входящих в регулоны систем “Quorum Sensing ”.
3. Белки шапероны и АТФ-зависимые протеазы.
3.1. Молекулярные шапероны би-шаперонной системы DnaKJE-
ClpB
3.2. Шаперон GroEL/GroES (HSP60).
3.3. Малые белки-шапероны IbpA/IbpB (sHSP) и шапероны ClpA
(HSP100).
3.4. АТФ-зависимые протеазы
3.5 Триггер-фактор

4. «Холодовой шок» мезофильных и психрофильных бактерий. 3.5. Белки «холодового шока» мезофильных бактерий. 3.6. Белки «холодового шока» психрофильных бактерий. 3.7. Перспективы применения белков «холодового шока». 37 38
5. Биосенсоры, основанные на индуцируемых промоторах и генах бактериальных люцифераз в качестве репортёрных. 5.1. Цельноклеточные бактериальные биосенсоры. 5.2. Ьих-биосенсоры. 41
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Бактериальные штаммы и плазмиды 2. Среды и условия роста бактерий 3. Выделение и очистка хромосомной и плазмидной ДНК, клонирование и рестрикционный анализ. 4. Определение нуклеотидной последовательности 5. Выделение и очистка белков и электрофорез в полиакриламидном геле. 6. Масс-спектрометрический анализ пептидов. 7. Термоинактивация и рефолдинг люциферазы 8. Ферменты и химические вещества.. 9. УФ-облучение 10. УФ-облучение суспензии бактерий в присутствии наночастиц диоксида титана. 11. Измерение степени окислительного стресса, «теплового шока» и SOS-omeema. 12. Измерение биолюминесценции клеток 45 45 50 50 50 50 51 51 52 52 52 53
РЕЗУЛЬТАТЫ 1. Lux-опероны психрофильных и мезофильных светящихся бактерий.

1.1. Изоляция психрофилъных люминесцирующих штаммов и идентификация видовой принадлежности.
1.2. Сравнительный анализ “Quorum Sensing ” систем Aliivibrio logei и Aliivibrio fischeri.
1.3. Сравнительный анализ lux-оперонов A. salmonicida и A. logei.
1.4. Особенности организации lux-оперона Photorhabdus luminescens

2. Влияние шаперонов и протеаз на “Quorum Sensing” систему регуляции экспрессии генов lux-оперона A. fischeri.
2.1 Влияние шаперона GroEL/ES и протеазы Lon на «Quorum Sensing» систему регуляции экспрессии генов lux-оперона A. fischeri.
2.2. Дефицит шаперона GroEL/ES компенсируется высокими концентрациями аутоиндуктора.
2.3. Исследование влияния шаперона GroEL/ES протеазы Lon на активность белка LuxR и его делетированных форм.
2.4. Участие протеазы ClpXP в негативной регуляции QS системы A. fischeri, защитное действие аутоиндуктора от протеаз ClpXP и Lon.

3. Определение активности шаперонов с помощью бактериальных люцифераз.
3.1. Определение активности бишаперонной системы DnaKJE-ClpB; обратная корреляция активности бишаперонной системы с терморезистентностъю люцифераз.
3.2. Влияние шаперона ClpA на DnaK-зависимый рефолдинг бактериальной люциферазы A. fischeri в клетках E. coli
3.4. Влияние шаперонов IbpAB на DnaK-зависимый рефолдинг бактериальной люциферазы A. fischeri в клетках E. coli
3.5. TF-зависимый рефолдинг в клетках E. coli.

4. Биосенсоры: применение 1их-биосенсоров для детекции
токсических агентов, антибиотиков, аутоиндукторов и других биологически активных веществ.

белок
полипептид і
Т.,г-'
олигопептад ;С( ‘

ди/три

пептиды ч

аминокислоты
. АТФ|
зависимые
лнфопьдазы (АТФ.иные суоъудпннцы) Эубактрии археи эукариоты
1_оп.С1рА. СІрХ.СІрУ 1.011, РАН 195 регулятор
АТФ- зависимые протеазы (пептида «ные суо ъедмницм) І.ОП. С1рР. СІрО Ьоп. 2*5 протеаеомл 2*5 проте,кома
АТФ-независимые пептидазы

Рисунок 5. Общая схема и ферменты, участвующие в деградации белков
в цитозоле клетки.
а) возможный вариант деградации внутриклеточных белков, приводящий к освобождению аминокислот из цельного белка. Инициация деградации зависит от АТФ-зависимых протеаз, далее деградацию ведут АТФ-независимые пептидазы. В таблице представлены регуляторные и протеазные субъединицы АТФ-зависимых протеаз различных царств;
б) связывание и стабилизация протеазных и регуляторных компонентов АТФ-зависимых протеаз СІрАР (сверху) и С1рУ<3 (снизу) в присутствии
7 субъединиц на
КОЛЬЦО