Биосинтез пептид-нуклеотидного антибиотика микроцина C и его гомологов

• Автор: Бантыш, Ольга Борисовна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 159 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Список сокращений и условных обозначений
Общая характеристика работы
Актуальность темы исследования
Цели и задачи исследования
Научная новизна и практическая значимость работы
Положения, выносимые на защиту
Степень достоверности и апробация результатов
Личное участие автора в проведении исследований
Обзор литературы
Бактериоцины
Микроцины
Микроцины класса
Микроцин В
Микроцин
Микроцин С7-С
Микроцин С - пептид-нуклеотидный антибиотик
История открытия микроцинов
Расшифровка структуры микроцина С
Гены синтеза микроцина С
Роль белков микроцинового кластера
Возможные гомологи генов микроцинового кластера
Регуляция генов микроцинового кластера
Механизм действия микроцина С
Антибактериальная активность микроцина С и его аналогов
Белок МссВ
Ферментативная функция белка МссВ
Структура белка МссВ
Положение пептидного субстрата в активном центре пептид-связывающего домена
Структура аденилирующего активного центра
Уникальные черты активного центра белка МссВ
Конформационная подвижность активных центров
E1 -суперсемейство
Филогенетическиое древо белков Е1 -суперсемейства
Характерные структурные элементы белков El-суперсемейства
Структурные особенности белков El-суперсемейства
Сравнительный структурный анализ некоторых представителей прокариотических белков Е1-суперсемейства
Биологическая роль белков ThiF и МоеВ
Сравнительный структурно-функциональный анализ белков El-суперсемейства МссВ, МоеВ, ThiF
Материалы и методы
Бактериальные штаммы
Геномная и плазмидная ДНК
Питательные среды
Отбор бактериальных колоний и их проверка на устойчивость к антибиотикам
Метод ПЦР
Праймеры для ПЦР
Праймеры для мутагенеза по методу Даценко-Уорнера
Электрофорез в агарозном геле
Извлечение фрагментов ДНК из агарозного геля
Расщепление ДНК рестриктазами
Лигирование фрагментов ДНК
Клонирование фрагментов ДНК
Мутагенез по методу Даценко-Уорнера
Приготовление химически компетентных клеток E. coli
Трансформация компетентных клеток E. coli
Пептиды
Получение и очистка рекомбинантных белков
Электрофорез белков в полиакриламидном геле (ПААГ)
Аденилирование пептидов in vitro
Масс-спектрометрический анализ (MALDI-MS и MS/MS)
Тесты на чувствительность к микроцину и его аналогам
Приготовление S30 клеточных экстрактов
Реакция аминоацилирования тРНК
Процессинг пептидов МссА в S30 экстрактах
Аминопропилирование аденилированного пептида МНММКО-АМФ L.johnsonii in vitro
Введение радиоактивной метки in vitro
Проверка токсичности аденилированного белка in vivo
Определение продуктов реакции с помощью ВЭЖХ
Биоинформатический анализ белковых последовательностей
Результаты работы
Часть 1. Изучение ортологов белка МссВ и микроцин С-подобных соединений, закодированных в шсс-подобных оперонах бактерий, отличных от Escherichia coli
Анализ результатов биоинформатического поиска гомологов микроцинового опсрона
Энзиматический синтез аденилированных пептидов in vitro
Биологическая активность аденилированных пептидов
Активность аденилированных пептидов in vitro
Биологическая активность аминопропилированных микроцин С-подобных соединений .
Филогенетическое древо МссВ-подобных аденилат-трансфераз
Анализ аминокислотных последовательностей ортологов МссВ
Часть 2. Получение новых антибактериальных пептид-нуклеотидных соединений с измененной пептидной частью с помощью белка МссВ E. coli
Поиск нового субстрата для белка МссВ E. coli путем трехмерного моделирования.
Тестирование различных пептидных субстратов белка МссВ in vitro
Биологическая активность аденилированных пептидов
Сравнение антибактериальной активности некоторых аналогов микроцина С
In vitro аденилирование белка, содержащего на своем С-конце пептид MRTGNAN
In vivo аденилирование белка, содержащего на своем С-конце пептид MRTGNAN
Обсуждение полученных результатов
Выводы
Список используемой литературы
Приложение
Благодарности

Микроцин обладает бактериостатическим действием. Это было продемонстрировано на клетках E. coli: в культуральную среду к клеткам добавляли микроцин С до конечной концентрации 0,4 мкМ. В этих условиях наблюдали угнетение роста бактериальных клеток. В то же время клетки сохраняли свою жизнеспособность в течение как минимум восьми часов и при пересеве их на свежую среду без антибиотика возобновляли свой рост [29].
Микроцин С активен не только против E. coli, но и против филогенетически близких к кишечной палочке штаммов, преимущественно Грамм-отрицательных бактерий [29]. Различными группами ученых были проведены тесты на чувствительность к МсС различных бактериальных штаммов. Результаты этих тестов отображены в таблицах 1-3.
Таблица 1. Антимикробная активность микроцина С (микроцина С7) [29].
„ Количество Вид чувствительных штаммов Всего тестировалось штаммов
Escherichia coli 6 ' T" " “ ‘
Klebsiella pneumoniae 1 2
Klebsiella oxytoca 0
Salmonella typhi 2
Salmonella typhimurium 1
Salmonella sp. 4
Shigella flexneri 1
Shigella sp. 2
Serratia marcescens 0
Proteus mirabilis 1
Proteus vulgaris 0
Erwinia herbicola Pse udomonas aeruginosa 0 0 1
Pseudomonas maltophilia 0
Staphylococcus aureus 0
Staphylococcus epidermidis 0
Bacillus amyloliquefaciens 0
Micrococcus luteus 0
Streptococcus agalactiae 0
Candida albicans 0
Rhodotorula mucilaginosa 0