Изучение структурно-функциональных особенностей δ-эндотоксина Cry9A Bacillus thuringiensis

• Автор: Кириллова, Нина Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с. : ил.

Оглавление
1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Ведение

2.2. Молекулярная организация Сгу-белков

2.2. 1. Первичная структура, филогенетическое родство, номенклатура

2.2.2. Пространственная организация молекулы Сгу-белков

2.2.3. Междоменные контакты. Поведение истинных

токсинов Сгу-белков в ходе денатурации

2.2.4 Ограниченный протеолиз Cry- белков

2.3. Механизм действия Сгу-белков

2.3.1.Специфичность инсектицидной активности
2.3.2. Общая схема патогенеза
2.3.3. Механизм порообразования
2.4. Взаимоотношение структуры и функции в молекулах Сгу-белков
2.4.1.Роль домена I в образовании пор
2.4.2.Мутагенез спирального домена
2.5. Организация генома B.thuringiensis
2.5.1 .Положение стр-генов в геноме В. thuringiensis
2.5.2. Регуляция синтеза 5- эндотоксинов
2.5.3. Промоторы
2.5.4. Копийность плазмид, включающих cry гены
2.5.5. мРНК
2.6. Токсическое действие Cry- белков на другие объекты
2.6.1. Антимикробная активность белков параспоральных
кристаллов В. thuringiensis.
2.6.2. Влияние биогенных аминов на микроорганизмы
2.6.3. Фунгицидное действие Сгу-белков

2.6.4. Действие на клетки теплокровных организмов
3. Материалы и методы
3.1. Используемые штаммы и среды
3.1.1. Выращивание штаммов Bt
3.1.2. Выращивание штаммов Escherichia coli
3.1.3. Выращивание анаэробных микроорганизмов
3.1.4. Выращивание Saccharomyces cerevisiae
3.2. Микроскопическое исследование культуры клеток бацилл
3.3. Получение активированного 6-эндотоксина Cry9А
3.4. Электрофорез в денатурирующих условиях
3.5. Иммунодиффузия по Оухтерлони
3.6. Ограниченный протеолиз
3.7.Хроматографическое разделение продуктов протеолиза
3.7.1. Гельпроникающая хроматография
3.7.2. Ионнообменная хроматография
3.8. Трансформация клеток Bt методом электропарации
3.9. Очистка антисывороток на афинных сорбентах
3.9.1 Синтез аффинного сорбента.
3.9.2. Хроматография антисыворотки на аффинном сорбенте
3.10 . Вестерн-блоттинг
3.11. Определение концентрации белка
3.12. Определение токсичности
3.13. Просвечивающая электронная микроскопия
3.14. Сканирующая электронная микроскопия
3.15. Конструирование плазмид для клонирования и
экспрессии фрагментов гена Сгу9А в E. coli
3.16. Введение аминокислотных замен в ген Сгу9А
методом сайт-направленногомутагенеза.
3.17. Конструирование плазмид, для экспрессии в Bt полученных
мутантных вариантов гена сгу9Л.
3.18. Проведение экспериментов по изучению влияния БА
на бактериоцидный эффект 1
3.18.1. Техника анаэробного культивирования
3.18.2. Определение биомассы

3.19. Мутагенез I домена Сгу9А методом «еггог-ргопе» ПЦР
и анализ токсичности на уровне экспрессии в Е. coli.
3.20. Изучение фунгицидного эффекта мутантных вариантов
Сгу9А на протопластах дрожжей Saccharomyces cerevisiae
3.20.1. Приготовление протопластов дрожжей с помощью
ферментативного разрушения клеточной стенки литиказой
3.20.2. Проведение экспериментов по изучению фунгицидного эффекта
4. Результаты и обсуждение
4.1. Введение. Постановка задачи исследования
4.2. Использование хроматографических методов для разделения
продуктов ограниченного протеолиза 6-эндотоксина Сгу9А
4.3. Разработка системы для экспрессия эндотоксина Сгу9А в
клетках акристаллического штамма Bt подвида kurstaki.
4.4. Доказательства экспрессии и правильного фолдинга
рекомбинантного Сгу9А в бациллярных клетках
4.4.1. Электрофорез и иммунологические тесты
4.4.2. Ограниченный протеолиз
4.5. Биологическая активность рекомбинантного Сгу9А
4.6. Формирование кристаллов рекомбинантным 5-эндотоксином Сгу9А
4.7. Получение точечных мутаций в области спиралей а5 и аб гена сгу9А
4.7.1. Создание модифицированной версии гена сгу9А, содержащей
уникальные сайты рестрикции, ограничивающие область, кодирующую спирали а5 и аб.
4.7.2. Сайт-направленный мутагенез в области спиралей а5 и аб
4.8. Выделение и изучение полученных мутантных белков

уменьшению токсичности к М. sexta и P. xylostella, а также способность к порообразованию в BBMV [Vachon, 2004] или фосфолипидных бислоях [Masson, 1999]. Например, замена (Q133R), приводящая к возникновению положительного заряда на гидрофобной поверхности, привела к потере токсичности белка. При этом мутантный белок, несущий замену Q133H, полностью сохранял активность нативного токсина.
Каналы, образованные мутантом D136C в искусственной фосфолипидной мембране обладали существенно уменьшенной
проводимостью по сравнению с исходным белком. Восстановление отрицательного заряда в 136-ом положении мутанта D136C модификацией SH- группы цистеина, произведённое непосредственно в образованном этим мутантом канале, увеличило проводимость последнего. Эксперимент был поставлен следующим образом. D136C после инкубации с искусственной фосфолипидной мембраной образовывал в ней каналы. В раствор, омывающий мембрану, содержащую эти каналы, добавили MTSES - вещество, способное легко диффундировать через каналы, и модифицировать SH-группы, смотрящие в просвет поры. Причём, в результате этой реакции на модифицированной SH- группе появляется отрицательный заряд. В нашем случае, если Cysl36 смотрит в просвет поры, то он будет модифицирован и отрицательный заряд, располагавшийся до мутации в этом месте у исходного белка (на D136), восстановлен. Видимо это и происходит, поскольку активность канала после инкубации с MTSES восстанавливается полностью. Из этого следуют два вывода: пору выстилает именно 4-я спираль и в просвет поры смотрит та её сторона, на которой находится D136 [Masson, 1999].
Роль петли, соединяющей четвёртую и пятую спирали, у разных токсинов различна. Так, в случае CrylAa замены в петле, соединяющей а4 и а5, как правило, не отражались на активности [Masson, 1999]. Видимо, эта петля после того, как вилка а4 - а5 пронизывает мембрану, располагается где-то рядом с внутренней границей последней и на свойства поры не влияет. В то же время мутации по Y153, расположенному в петле ос4-а5 Cry 1 Ас (на той же