Экспрессия и функции генов семейства p53 в опухолях желудочно-кишечного тракта

• Автор: Вильгельм, Анна Эдгартовна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 156 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Цель и задачи исследования

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Семейство р

Организация.генов семейства р53 и изоформы их белковых продуктов

Транскрипционная активность белков семейства р

Роль белков семейства р53 в онкогенезе и опухолевой прогрессии

Первичные опухоли
Мышиные модели
ТА изоформы белков рбЗ и р73 и опухолевая супрессия
Дельт аИ — онкоген
Баланс ТА/АИ
Белки семейства р53 и противоопухолевая терапия
Семейство р53 - интерактивная система
Множественная лекарственная устойчивость опухолей
Р-гликопротеин: механизм действия и функции
Регуляция экспрессии гена тс!г
Опухолевый супрессор Шс
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Реактивы
Образцы ткани человека, получение МТП
Линии эукариотических клеток и условия их культивирования, получение
стабильных клеточных линий
Плазмидные векторы
Интерференция РНК
Анализ содержания мРНК

Выделение РНК
Обратная транскрипция РНК
ПЦР с детекцией в режиме реального времени
Определение содержания мРНКр73, кодирующих белки с различным
строением С-концов молекулы
Анализ содержания исследуемых белков
Определение содержания исследуемых белков в первичных опухолях
Содержание исследуемых белков в культивируемых клетках,
иммуноблоттинг
Выделение белков из линейных клеток
Электрофорез белков
Перенос белков с геля на мембрану
Гибридизация мембраны с антителами
Анализ ДНК-белковых взаимодействий
Иммуноблоттинг белков, аффинных к ДНК (DNA-affmity immunoblotting,

Приготовление зондов для DAI
Порядок проведения DAI
Иммунопреципитация хроматина
Последовательная иммунопреципитация хроматина
Анализ активности Р-гликопротеина (Pgp)
Анализ регуляции промоторов
Измерение общей транскрипционной активности эндогенных белков
семейства р
Анализ способности клеток к неприкрепленному росту
Оценка чувствительности клеток к действию 5-FU
МТТ тест
Детекция апоптоза
Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла

Статистическая обработка данных
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Экспрессия генов семейства р53 в опухолях ЖКТ человека
Экспрессия генов семейства р53 в колоректальных карциномах
Содержание белка и мРНК АКр73 в опухолях желудка и пищевода
Белок А1Чр73 придает неопухолевым клеткам эпителия желудка
способность к неприкрепленному росту
Регуляция синтеза мРНК АХр
Анализ промотора Р2 т вШсо
Белок Шс1 подавляет синтез мРНК АЫр
Белок Шс1 связывается с промотором Р2 гена ТР
Белок Шс 1 блокирует активацию промотора Р2 гена ТР73 белками р53 и

Регуляция транскрипции мРНК АЫр73 т шуо
Белки семейства р53 и эффективность противоопухолевой химиотерапии

Роль белка р73 в регуляции экспрессии гена тс1г
Белок АМр73а активирует экспрессию гена тс!г
Белок АМр7За увеличивает Р^р-опосредованный транспорт
Белок АМр73а подавляет р53-опосредованную транскрипционную
репрессию гена тбг
Белки семейства р53 и их взаимодействия определяют
химиотерапевтическую чувствительность опухолевых клеток
Белки р73 и рбЗ принимают участие в ответе клеток на воздействие
противоопухолевого препарата 5-фторурацил (5-ФУ)
Белкир53, рбЗ ир73 попарно связываются с промоторами генов-мишеней
р53 под действием противоопухолевого препарата 5-ФУ
Суммарная транскрипционная активность белков семейства р53 определяет чувствительность клеток к воздействию 5-ФУ

подавляет рост раковых клеток in vitro и in vivo. Вероятно, этот эффект обусловлен нарушением взаимодействия белков ТАр73 и мутантного р53 [Kravchenko, Ilynskaya et al., 2008]. •
Белки семейства р53 также регулируют синтез друг друга на уровне транскрипции мРНК. Гены ТР53 и ТР73 содержат p53-RE. Показано, что белки р53 и ТАр73 связываются с этими элементами, увеличивая тем самым собственную транскрипцию [Chen, Zheng et al., 2001; Wang and El-Deiry, 2006; Wang, Lin et al., 2007]. Интересно отметить, что белки р53 и ТАр73 также активируют транскрипцию собственного ингибитора - белка ANp73, промоторная область которого тоже содержит p53-RE [Grob, Novak et al., 2001; Kartasheva, Contente et al., 2002; Nakagawa, Takahashi et al., 2002]. Более того, доминантно-негативные члены семейства р53 способны усиливать собственную транскрипцию. В частности, под действием доксорубицина, мутантный белок р53 и белок ÄNp73 взаимодействуют с промотором Р2 гена ТР63 и увеличивают синтез мРНК ANp63 за счет активации ССААТ бокса [Lanza, Marinari et al., 2006]. Последовательность ССААТ, или ССААТ бокс - цис-регуляторная последовательность, характерная для промоторов многих кодирующих белки генов эукариот. Она отвечает за активацию транскрипции и регулируется транскрипционным фактором NT-Y [Mantovani, 1999]. Таким образом, члены семейства р53 могут регулировать собственную транскрипцию по принципу как отрицательной, так и положительной обратной связи.
Показано, что белок р73 влияет на ДНК-евязывающуго способность белка рбЗ. Снижение синтеза белка р73 под действием специфической siRNA нарушает связывание белков ТАрбЗу и АЫрбЗу с ДНК-зондом, комплементарным регуляторной последовательности промотора гена р21 в кератиноцитах мыши [Johnson, Lagowski et al., 2007]. Белок p73 также регулирует внутриклеточную локализацию транскрипционного фактора1 р53. Аденовирусная доставка вектора, направляющего синтез белка ТАр73, в клетки нейробластомы приводит к транслокации неактивного цитоплазматического