Мембраномоделирующие среды для бесклеточной продукции мембранных белков

• Автор: Хабибуллина, Нелли Фамзуловна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 134 с. : ил.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Мембранные белки и формирование их пространственной структуры in vitro

1.2. Бесклеточные белоксинтезирующие системы

1.3. Продукция мембранных белков в бесклеточных системах синтеза

1.4. Модификация У- и С-концевых последовательностей мембранных белков для повышения уровня бесклеточного синтеза и эффективности очистки

1.5. Тирозинкиназы семейства рецепторов эпидермального фактора роста человека

1.6. Мускариновые ацетилхолиновые рецепторы человека

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы

2.1.1. Реактивы и ферменты
2.1.2. Штаммы
2.1.3. Плазмидные векторы
2.1.4. Питательные среды для роста бактериальных культур
2.1.5. Синтетические олигонуклеотиды
2.2. Методы
2.2.1. Общие молекулярно-генетические методы
2.2.1.1. Трансформация клеток E. coli плазмидной ДНК
2.2.1.2. Выделение плазмидной ДНК
2.2.1.3 .Расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции, выделение ДНК из агарозного геля и лигирование
2.2.2. Получение генетических конструкций
2.2.2.1. Получение генетических конструкций, содержащих ген ТМ-ЕгЬВЗ
2.22.2. Получение генетических конструкций, содержащих ген укороченного мускаринового ацетилхолинового рецептора Ml типа
2.2.2.2.1. Конструирование гена укороченного варианта М1-мАХР
2.2.2.2.2. Конструирование генетических последовательностей, кодирующих варианты М1-мАХР с различными У-концевыми последовательностями
2.2.2.2.3. Получение генетической конструкциирЕТ22Ъ(+)/Т7-таг- М1-мАХР
2.2.2.2.4. Получение генетической конструкции pET22b(+)/S-maz-Ml-MAXP
2.2.2.2.5. Получение экспрессирующих векторовpET22b(+)/ESR-maz-Ml-MAXP
2.2.3. Продукция мембранных белков в бесклеточной системе на основе экстракта S30 Escherichia coli
2.2.3.1. Выделение экстракта S30 из E
2.2.3.2. Синтез белка в бесклеточной системе на основе экстракта S30 из E
2.2.4. Гель-электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН
2.2.5. Вестерн-блотгинг
2.2.6. Гель-фильтрация
2.2.7. Анализ белковых препаратов методом КД-спектроскопии
2.2.8. Ренатурация ТМ-ЕгЬВЗ из осадка PC
2.2.9. Солюбилизация М1-мАХР с различными У-концевыми последовательностями из осадка РС70

2.2.10. Солюбилизация мутантного укороченного варианта М 1-мАХР из осадка РС
2.2.11. Встраивание М 1-мАХР в липосомы
2.2.12. Анализ лиганд-связывающей активности М1-мАХР
2.2.13. Выделение ТМ-ЕгЬВЗ и М1-мАХР, синтезированных в присутствии детергентов, из реакционной смеси
2.2.14. Выделение белка, ассоциированного с липид-белковыми нанодисками
2.2.15. Химическое кросс-сшивание ТМ-ЕгЬВЗ по свободным аминогруппам
2.2.16. Исследование лиганд-связывающей активности М1-мАХР, встроенного в липид-белковые нанодиски, с помощью спектроскопии ЯМР
2.2.17. Получение ЯМР-спектров ТМ-ЕгЬВЗ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Бесклеточная продукция трансмембранного домена рецепторной тирозинкиназы ЕгЬВЗ человека
3.1.1. Мутагенез ТМ-ЕгЬВЗ человека
3.1.2. Оптимизация бесклеточной белоксинтезирующей системы для продукции ТМ-ЕгЬВЗ
3.1.3. Выделение и очистка ТМ-ЕгЬВЗ из осадка реакционной смеси
3.1.4. Пространственная структура ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии мицелл ДФХ, переход “мономер-димер”
3.1.5. Синтез ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии мицелл детергентов
3.1.6. Синтез ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии бицелл и липосом
3.1.7. Синтез ТМ-ЕгЬВЗ в присутствии лпид-белковых нанодисков
3.2. Бесклеточная продукция мускаринового ацетилхолинового рецептора М1 типа
3.2.1. Дизайн гена М1
3.2.2. Бесклеточный синтез М 1-мАХР с различными Д-концсвыми партнерами
3.2.3. Синтез ЕБИ-таг-М 1-мАХР в растворимой форме в присутствии мицелл детергентов
3.2.4. Синтез ЕБЯ-таг-М 1-мАХР в присутствии липид-белковых нанодисков
3.2.5. Ренатурация ЕБЯ-таг-М 1-мАХР из осадка реакционной смеси
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АКТ - протеинкиназы В человека, играющие роль в регуляции клеточного цикла, апоптоза, клеточной пролиферации и миграции
а.о. - аминокислотный остаток
АТФ - аденозинтрифосфат
АХ - ацетилхолин
ББС - бесклеточная белоксинтезирующая система
ДГФХ - дигексаноилфосфатидилхолин
ДДМ - п-додецил-Р-Б-мальтозид (додецилмальтозид)
ДМФГ - димиристоилфосфатидилглицерин ДМФХ - димиристоилфосфатидилхолин ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДОФГ - д иол еилфосфатид ил глицерин ДОФХ - диолеилфосфатидилходин ДПФХ - дипальмитоилфосфатидилхолин ДСН - додецилсульфат натрия ДСФХ - дистеароилфосфатидилхолин ДТСП - дитиобис(сукцинимидил пропионат)
ДТТ - 1,4-дитиотреитол ДФХ - додецилфосфохолин ИЗФ — инозитол-3-фосфат
эффективной экспрессии генов белков человека, а его аминокислотная последовательность является тагом для очистки белка.
В одной из недавних работ было проанализировано влияние семи различных тагов на уровень продукции шести белков [86]. Было показано, что эффективность индивидуального тага в каждом конкретном случае зависит не только от нуклеотидной последовательности тага, но и от последовательности, кодирующей ген целевого белка. Следовательно, понятие об “универсальной эффективности” того или иного тага для синтеза различных белков не является верным. Таким образом, для повышения уровня продукции каждого целевого белка необходимо тестировать различные партнерные последовательности. При этом необходимо учитывать влияние партнера не только на уровень синтеза целевого белка, но и на его структурные и функциональные характеристики.
В последнее время с целью повышения уровня экспрессии мембранных
белков с использованием клеток E. coli исследователи в качестве TV-концевого
партнера все чаще используют Mistic - интегральный мембранный белок
Bacillus subtilis [90]. Интересен тот факт, что, несмотря на отсутствие каких-
либо сигнальных последовательностей, этот белок имеет большое сродство к
мембране E. coli и способен взаимодействовать с комплексом транслокона
бактерии. При этом Mistic, расположенный в TV-концевой последовательности
целевого белка, способствует встраиванию белка в мембрану в нативной
конформации [90]. Имеются многочисленные данные по применению Mistic
для продукции мембранных белков. В одной из опубликованных работ было
показано, что Mistic значительно увеличивает выход гистидиновых киназных
рецепторов E. coli, при этом гибридные рецепторы сохраняют
автофосфорилирующую активность [91]. Также благодаря использованию
Mistic была разработана эффективная система бактериальной продукции
бактериородопсина, конечный выход очищенного и ренатурированного белка
составил 120 мг/л культуры [92]. Кроме того, использование гибридных
конструкций с Mistic в качестве iV-концевого белка-партнера позволило с