Циркулирующие РНК плазмы крови человека

• Автор: Барякин, Дмитрий Николаевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 150 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА I ЦИРКУЛИРУЮЩИЕ РНК ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1 История развития представлений о циркулирующих НК
1.2 Формирование набора цРНК
1.3 Основные классы циркулирующих РНК
1.4 Формы транспорта циркулирующих РНК
1.4.1 Экзосомы и микровезикулы
1.4.2 Апоптотические тельца
1.4.3 Липопротеиды высокой плотности
1.4.4 Свободные рибонуклеопротеидные комплексы
1.5 Проникновение РНК в клетки-реципиенты
1.6 Биологические функции циркулирующих РНК
1.6.1 Неспецифическое действие циркулирующих РНК
1.6.1.1 Свертывание крови
1.6.1.2 Врожденный иммунитет
1.6.2 Специфическое действие циркулирующих РНК
1.6.2.1 Регуляция иммунного ответа
1.6.2.2 Регуляция липидного обмена и развития атеросклероза
1.6.2.3 Регуляция образования и развития опухолей
1.6.2.4 Дифференцировка и морфогенез
1.7 Циркулирующие РНК как показатель состояния организма
1.7.1 Циркулирующие РНК плода и плаценты в крови матери как показатель протекания беременности
1.7.2 Циркулирующие РНК при сердечно-сосудистых заболеваниях
1.7.3 Циркулирующие РНК при воспалительных и системных заболеваниях
1.7.4 Циркулирующие РНК при онкологических заболеваниях
1.7.4.1 Рак молочной железы
1.7.4.2 Рак легкого
1.7.4.3 Циркулирующие микроРНК при других типах рака
1.7.5 Диагностический потенциал циркулирующих микроРНК
1.8 Заключение
ГЛАВА 2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1 Материалы и реактивы
2.2 Ферменты

2.3 Буферные растворы
2.4 Методы
2.4.1 Конструирование кДНК-библиотек для высокопроизводительного секвенирования
2.4.2 Биоинформационный анализ данных высокопроизводительного секвенирования
2.4.3 Подтверждение данных секвенирования методом ПЦР в режиме реального времени
2.4.4 Синтез аналогов РНК плазмы крови человека
2.4.5 Культуры эукариотических клеток
2.4.6 Выделение суммарной РНК из клеток MCF-
2.4.7 Синтез аналогов AluYa5 РНК и 7SL РНК человека
2.4.8 Анализ жизнеспособности клеток MCF-7 после трансфекции синтетическими РНК
2.4.9 Анализ проапоптотнческих изменений клеток MCF-7 с помощью проточной цитофлуориметрии
2.4.10 Анализ изменений транскриптома клеток MCF-7 под действием аналогов Alu- и 7SL РНК на чипах Illumina НТ-
2.4.11 Статистические методы анализа полученных результатов
ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Определение последовательностей коротких РНК плазмы крови человека с помощью высокопроизводительного секвенирования по технологии SOLiD
3.1.1 Подбор здоровых доноров и пациентов с немелкоклеточным раком легкого
3.1.2 Конструирование кДНК-библиотек SOLiD на основе РНК плазмы крови человека
3.1.3 Относительный вклад основных групп транскриптов в набор РНК плазмы крови человека
3.1.4 Описание форм РНК плазмы крови человека по классам
3.1.4.1 МикроРНК
Формы транспорта микроРНК в плазме крови человека
Регуляторный потенциал циркулирующей микроРНК-
3.1.4.2 мРНК
3.1.4.3 Митохондриальные РНК
3.1.4.4 Длинные некодирующие РНК
3.1.4.5 Новые микроРНК-подобные формы
3.1.5 Сравнение вклада отдельных форм РНК плазмы крови здоровых доноров и пациентов с НМРЛ
3.2 Влияние аналогов РНК плазмы крови человека на жизнеспособность клеток человека
в культуре
3.2.1 Снижение жизнеспособности клеток MCF-7 под действием аналогов РНК плазмы крови человека
3.2.2 Влияние аналогов Alu и 7SL РНК на проапоптотические процессы в клетках аденокарциномы молочной железы человека MCF-
3.2.3 Влияние Alu РНК и 7SL РНК в сочетании с цитостатиками на жизнеспособность клеток

3.2.4 Анализ изменения экспрессии генов в клетках MCF-7 под действием аналогов Alu и
7SL РНК
3.2.5 Предполагаемый механизм снижения жизнеспособности клеток MCF-7 под действием Alu и 7SLPHK
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

В эксперименте с культурами мезенхимальных стволовых клеток и первичными культурами нейронов и астроцитов показано, что посредством экзосом происходит перенос микроРНК-133Ь, который приводит к образованию нейритного выроста [156].
Таким образом, циркулирующие РНК плазмы крови оказывают значительное влияние на жизненно важные процессы в организме человека в норме и при развитии патологических состояний.
1.7 Циркулирующие РНК как показатель состояния организма
Изменение набора РНК в системной циркуляции в результате развития патологических процессов в организме может служить малоинвазивным маркером этих процессов.
До появления технологий высокопроизводительного секвеиирования основным методом, применяемым для поиска циркулирующих РНК-маркеров, была обратная транскрипция-амплификация со специфическими праймерами. Основными мишенями для анализа служили опухоль-специфические РНК. Однако использование такого подхода для определения циркулирующих в крови РНК-маркеров давало противоречивые результаты.
Так, одним из наиболее показательных примеров несоответствий в экспериментальном подтверждении диагностической значимости цРНК является использование мРНК тиреоглобулина для диагностики онкотрансформации щитовидной железы. В ряде работ показано, что мРНК тиреоглобулина позволяет с высокой точностью (более 80%) детектировать рак щитовидной железы, появление метастазов и рецидив заболевания [157, 158, 159]. С другой стороны, установлено, что использование мРНК тиреоглобулина для обнаружения рецидива рака щитовидной железы нецелесообразно из-за низкой точности анализа [160]. В работе Denizot и соавт. установлено, что чувствительность выявления рака щитовидной железы с использованием мРНК тиреоглобулина не превышает 15% [161]. Eszlinger и соавт. провели анализ содержания мРНК тиреоглобулина в крови нескольких групп допоров: здоровые доноры, пациенты с автономией щитовидной железы, болезнью Грейвса, с синдромом эутиреоидного зоба и пациенты с раком щитовидной железы с выявленными метастазами и без них. Показано, что достоверных отличий в уровне мРНК тиреоглобина исследованных групп пациентов и здоровых доноров не детектируется [162].
Тем не менее, стандартизация методик выделения РНК, использование в качестве источника РНК не цельной крови, а плазмы или сыворотки, а также применение новых способов нормализации данных ПЦР привели к устранению противоречий и повышению диагностических параметров разрабатываемых тест-систем онкологических заболеваний на основе РНК-маркеров. Широкое распространение анализа РНК методом ОТ-ПЦР в реальном времени позволило определять не только качественный состав диагностически значимых форм