Бактериальные системы рестрикции-модификации IIS типа: структура оперонов, клонирование и изучение свойств ДНК-метилтрансфераз

• Автор: Нетесова, Нина Александровна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Кольцово
• Количество страниц: 189 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бактериальные системы рестрикции-модификации и структура их оперонов

1.1. Распространенность систем рестрикции-модификации в бактериях

1.2. Защитная функция систем рестрикции-модификации

1.3. Другие возможные функции систем рестрикции-модификации

1.4. Типы систем рестрикции-модификации

1.4.1. Системы рестрикции-модификации типа I

1.4.2. Системы рестрикции-модификации типа II
1.4.3. Системы рестрикции-модификации типа IIS
1.4.4. Системы рестрикции-модификации типа III '
1.4.5. Другие системы рестрикции-модификации
1.5. Структура оперонов РМ-систем
1.6. Структура оперонов РМ-систем типа IIS
1.7. Строение и свойства ДНК-метилтрансфераз РМ-систем типа II
1.7.1. SAM-зависимое ферментативное метилирование
1.7.2. Первичная структура ДНК-метилтрансфераз
1.7.3. Пространственная структура ДНК-метилтрансфераз
1.7.4. Субстратная специфичность ДНК-метилтрансфераз типа II
1.7.4.1. Субстратная специфичность ДНК-метилтрансфераз типа ИР
1.7.4.2. Субстратная специфичность ДНК-метилтрансфераз типа IIQ и

1.7.4.3. Неспецифическая активность ДНК-метилтрансфераз типа II
1.8. Механизмы реакций метилирования ДНК и биохимические
свойства ДНК-метилтрансфераз
1.8.1. Механизм катализа аминометилаз
1.8.2. Метилирование эндоциклического С5-атома цитозина
1.8.3. Биохимические свойства ДНК-метилтрансфераз типа II

1.8.4. Кинетические свойства ДНК-метилтрансфераз типа II
ЗАКЛЮЧЕНИЕ '
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.2. МЕТОДЫ
2.2.1. Получение препаратов ДНК
2.2.2. Трансформация компетентных клеток плазмидной-ДНК
2.2.3. Постановка ферментативных реакций'
2.2.4. Метод селективной супрессии полимеразной цепной реакции
2.2.5. Определение нуклеотидных последовательностей
2.2.6. Экспрессия генов ДНК-метилтрансфераз
2.2.7. Определение биохимических свойств препаратов ДНК-метилилтрансфераз
2.2.8. Определение стационарных кинетических параметров реакций, катализируемых ДНК-метилтрансферазами
2.2.9. Статистическая обработка результатов и анализ аминокислотных последовательностей
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ -
3.1. Определение структуры оперона РМ-системы Лл/Т’51
3.1.1. Получение геномной библиотеки по БСК8р221 и плазмиды рБ5-1
3.1.2. Получение геномной библиотеки по БСАМ и плазмиды рГ5-21
3.1.3. Получение геномной библиотеки по Л.Вз1Х21 и плазмиды рБ5-32
3.1.4. Картирование участка ДНК, несущего вставки из плазмид рЕ5-1, рБ5-21 и рЕ5-32
3.1.5. Анализ аминокислотных последовательностей трех рамок считывания
3.1.5.1. ДНК-метилтрансфераза М1.Вз1Е51
3.1.5.2. ДНК-метилтрансфераза М2.В81Б51 *
3.1.5.3. ДНК-метилтрансфераза М3.В81Б51
3.1.6. ДНК-метилтрансфераза М4.Вз1Е51
3.1.6.1. Анализ первичной структуры четвертой рамки считывания

3.1.6.2. Определение первичной структуры гена M4.BstF5I
3.1.6.3. Клонирование гена &S/F5M4
3.1.6.4. Определение типа ДНК-метилтрансферазы M4.BstF5I
3.1.7. Клонирование гена 6s/F5IR
3.1.8. Расположение генов в опероне РМ-системы Bsl'5l
3.2. Определение структуры оперона РМ-системы Faul
3.2.1.Определение нуклеотидной последовательности оперона РМ-системы Faul
3.2.2. Определение функции белка, кодируемого ОРТ 1
3.2.3. Определение функций белков, кодируемых ОРТ2 и ОРТ4
3.2.4. Определение функции белка, кодируемого ОРТЗ
3.3. Определение структуры оперона РМ-системы SfäNl
3.3.1. Определение нуклеотидной последовательности оперона PM- 120 системы SfaNl
3.3.2. Анализ ОРТ1 РМ-системы SfaNl
3.3.3. Анализ ОРТ2 РМ-системы 5/nNI ' _
3.3.4. Расположение генов МТаз, узнающих сайт 5’-GCATC-3’, в ДНК бактерий В. stearothermophilus 19, В. halodurans С-
и S. faecalis ND547
3.3.5. Сравнение метилтрансферазы M.SfaNI с другими метилазами
3.4. Экспрессия генов ДНК-метилтрансфераз РМ-системы BstF5l в
кле тках E. coli
3.5. Определение оптимальных условий функционирования метилаз in vitro
3.5.1. Зависимость активности ферментов от температуры
3.5.2. Зависимость активности ферментов от величины pH
3.5.3. Зависимость активности ферментов от концентраций ионов Na+ и К+
3.6. Определение субстратной специфичности ДНК-метилтрансфераз
3.6.1. Определение цепи, модифицируемой Ml.BstF5I
3.6.2. Определение цепи, модифицируемой M3.BstF5I

вследствие дивергентной эволюции может быть 10% или ниже [107]. Поразительно, что ДНК-метилтрансферазы, принадлежащие системам рестрикции-модификации, имеют ту же структуру ядра, что и метилтрансферазы, модифицирующие мелкие молекулы и белки. Например, катехол-О-метилтрансфераза, метилирующая катехолы, имеет ту же структуру ядра, что и ДНК-метилтрансфераза Hhal [251]. Катехолдопамин имеет молекулярную массу около 150, тогда как 12-мерный дуплексный субстрат имеет молекулярную массу почти 8000. Как оказалось, природа' нашла изящное решение задачи, метилирования больших молекул, и ДНК-метилтрансферазы не метилируют ДНК непосредственно — они метилируют определенное пуриновое или пиримидиновое основание в молекуле ДНК. Молекулярная масса отдельного нуклеотида в среднем составляет 330, что соответствует размерам мелких модифицируемых молекул. Первоначально такой механизм метилирования ДНК-метилтрансферазами был показан для 5тС-метилтрансферазы Hhal [126] и детально будет обсуждаться в главе
1.8.1. В комплексе «белок-ДНК» цитозиновое основание-мишень уже не находится в двойной спирали; цитозин повернулся на 180° на ее фланкирующих сахарофосфатных связях, так что он выдается наружу в каталитический «карман», который обычно бывает вогнутым. Ковалентные связи в ходе этого процесса, который называется переворотом оснований, сохранились, тогда, как стэкинг-взаимодействия и водородные связи спаренных оснований оказались нарушены. Впоследствии переворот оснований был обнаружен в. ряде других ферментов, действующих на основания ДНК [55, 72, 198, 220].
1.7.2. Первичная структура ДНК-метилтрансфераз
Как уже говорилось ранее, ДНК-метилтрансферазы являются ферментами сайт-специфической модификации ДНК, в ходе которой происходит перенос метильной группы из S-аденозилметионина (SAM) на цитозин или аденин, находящиеся в сайте узнавания в молекуле ДНК. По