Взаимодействие энтомоцидных белков Bacillus thuringiensis с пищеварительной системой чувствительных насекомых на примере δ-эндотоксинов Cry3A и Cry9A

• Автор: Булушова, Наталья Владимировна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 160 с. : ил.

Оглавление
1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Организация Сгу-белков

2.1.1. Физико-химические свойства Cry-белков

2.1.2. Сравнение первичной структуры Сгу-белков

2.1.3. Пространственная организация молекулы Cry-белков

2.1.4. Механизм действия Cry-белков

2.2. Пищеварительные эндопептидазы насекомых

2.2.1. Общая характеристика ферментов

2.2.2. Связь между набором кишечных протеиназ и pH. Компартментализация средней кишки
2.2.3. Множественные формы кишечных протеиназ насекомых
2.2.4. Изменение спектра кишечных протеиназ в ходе развития насекомого
2.2.5. Индуцибельный характер синтеза протеолитических ферментов
насекомых
2.2.6. Эволюция кишечных протеиназ
2.3. Ограниченный протеолиз Cry- белков
2.3.1. Ход ограниченного протеолиза Cry-белков определяется особенностями их пространственной структуры ........................30 .
2.3.2. Особенности действия пищеварительных протеиназ насекомых
на 8-эндотоксины ВТ
2.4. Рецепторы Cry-белков в мембранах кишечного эпителия чувствительных насекомых
2.4.1. Связывание Cry-белков с мембранами кишечного эпителия чувствительных насекомых
2.4.2. Кадгериноподобный рецептор Cry-белков
2.4.3. Расположение сайтов связывания с токсинами в молекуле кадгериноподобных белков
2.4.4. Элементы структуры Cry-белков, ответственные за связывание с кадгериноподобным рецептором

2.4.5. Доказательство участия кадгериноподобных рецепторов в

токсическом эффекте Cry-белков in vivoi
2.4:6; Токсинсвязывающие свойства аминопептидазы N
2.4.7. Механизм взаимодействия Cry-белков с аминопептидазой N
2.4.8. Аминопептидаза N, как кандидат на роль рецептора Сгу-белков
2.4.9. Щелочная фосфагаза
2.4.10. ADAM металлопротеиназа
2.4.11. Альфа-амилаза
2.4.12. Так что же является рецептором 8-эндотоксинов ВТ в организме
чувствительных насекомых?
2.4.13. Механизм бивалентного взаимодействия токсина с апикальной
мембраной клеточного эппгелия
2.4.14. Другие кандидаты на роль рецептора Cry-белков
2.4.15. Альтернативные представления о механизме действия
токсинов
2.5. Изучение способности токсинов ВТ образовывать поры или ионные
каналы в искусственных и плазматических мембранах
2.5.1. Участие а-спиралей домена 1 в образовании пор
2.5.2. Изучение взаимодействия с мембранами синтетических пептидов, соответствующих а-спирагшм N-концевого домена
2.5.3. Мутагенез спирального домена
2.5.4. Свойства пор, образуемых активированными токсинами ВТ в искусственных фосфолипидных мембранах и мембранах
чувствительных клеток
Электрическая проводимость пор
Размер пор
Ионная селективность
2.5.5. Олигомеризация Сгу-белков и ее связь с порообразованием
3. Материалы и методы
3.1. Материалы
3.2. Получение кишечного экстракта гусениц G. mellonella
3.3. Определение общей протеолитической активности

3.4. Определение триптической активности
3.5. Определение активности химотрипсина
3.6. Определение активности пролинэндопептидазы
3.7. Определение активности металлопротеиназ
3.8. Изучение влияния pH на протеолитическую активность экстракта средней кишки <7. теИопеПа
3.9. Изучение влияния ингибиторов на протеолитическую активность
кишечного экстракга гусениц О. теИопеПа
3.10. Определение постэлекгрофоретической активности методом зимографии
3.11. Электрофорез в денатурирующих условиях
3.12. Выделение трипсина из кишечного экстракта О. теИопеПа
3.13. Определение И-концевой аминокислотной последовательности
3.14. Выделение химотрипсина из кишечного экстракта С. теИопеПа
3.15. Выделение 8-эндотоксинов
3.16. Ограниченный протеолиз энтомоцидных белков
3.17. Вестерн-блотгинг
3.18. Определение концентрации белка
3.19. Биотинилирование белков
3.20. Получение препаратов везикул апикальных мембран (ВВМУ) кишечного эпителия личинок Т.тоШог и гусениц & теИопеПа
3.21. Определение активности лейцинаминопептидазы
3.22. Определение активности щелочной фосфатазы
3.23. Изучение белкового состава апикальной мембраны клеток кишечного эпителия
3.24. Синтез аффинных сорбентов СгуЗА4свда- и Сгу9Ай5кда-амипогексилагарозы
3.25. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков Т. тоШог
3.26. Аффинная хроматография экстракта мембранных белков О.теИопеИа
3.27. Лиганд-блотгинг
3.28. Изучение связывания белков, элюированных с аффинных сорбентов

штаммами касалось только скорости- процесса. Продукты протеолиза. - как промежуточные, так и конечные, а также образующиеся в небольшом количестве продукты дальнейшей деградации активированного токсина - во- всех случаях были одинаковы.
Метод зимографии показал, что количественный и. качественный! состав кишечных экстрактов из сравниваемых штаммов различается. В частности, уменьшение скорости активации протоксинов кишечным' экстрактом! YHD2-B коррелирует с общим уменьшением специфической активности по гидролизу BzRpNA и отсутствием 32 кДа трипсиноподобной протеиназы. В свою очередь, ухудшение протеолиза токсинов в случае мутанта СХС коррелирует с уменьшением уровня 36< кДа химотрипсиноподобного белка [Karumbaiah et al, 2007]. Ослабление общей активности сериновых протеиназ и их способности активировать протоксин CrylAb, возможно является причиной возникновения устойчивости к этому токсину у устойчивого штамма Ostrinia nubilaris [Li et al, 2004].
8-Эндотоксин CiylC обладает токсичностью по-отношению к гусеницам Spodoptera littoralis. При этом личинки первых возрастов оказываются значительно более чувствительными к токсину, чем более зрелые. Было показано, что инкубация Cry 1C с кишечным соком из личинок 1-го и 2-го возрастов оставляет часть токсина интактным, тогда как кишечный сок из насекомых 5-го возраста полностью разрушает токсин. Это связано с качественным возрастным изменением синтезируемых кишечных протеиназ, которое следует из ингибиторного анализа [Keller et al, 1996].
Кишечный сок лабораторной популяции Helicoverpa armigera с 75-кратно увеличенной устойчивостью к 8-эндотоксину CrylAc вызывает неправильный процессинг протоксина, в результате которого образуется не 65 кДа конечный продукт, как у чувствительной популяции, а полупродукты с мол. массой 95 и 68 кДа [Rajagopal et al, 2009].
Таким образом, различные изменения в ходе протеолиза 8-эндотоксинов -замедление активации или деградация активированного токсина, могут служить, самостоятельно или совместно с другими факторами, причиной приобретения насекомыми устойчивости к токсинам ВТ.