Генетическая вариабельность вируса клещевого энцефалита в природных очагах Новосибирска и его окрестностей

• Автор: Ткачев, Сергей Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 192 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Морфология вирионов
1.2. Организация генома вируса клещевого энцефалита
1.3. Молекулярно-генетическая характеристика белков ВКЭ
1.3.1. Процессинг полипротеина
1.3.2. Структурные белки вириона
1.3.2.1. Белок капсида С
1.3.2.2. Мембранный белок М
1.3.2.3. Белок оболочки вириона Е
1.3.3. Неструктурные белки ВКЭ.
1.3.3.1.БелокН81
1.3.3.2. Малые неструктурные белки КБ2А, №2В, ЫБ4А и N848
1.3.3.3. БелокN83
1.3.3.4. Белок N85.
1.3.4. Короткие полипептиды ВКЭ.
1.4. Таксономия флавивирусов
1.4.1. Антигенные комплексы флавивирусов.
1.4.2. Классификация вирусов по Балтимору.
1.4.3. Классификация флавивирусов, основанная на молекулярно- 38 генетических методах.
1.5. Классификация вируса клещевого энцефалита
1.5.1. Антигенные подтипы ВКЭ.
1.5.2. Генотипы ВКЭ.
1.5.3. Типирование ВКЭ, основанное на анализе маркерных аминокислот.
1.5.4. Кластероны ВКЭ.
1.5.5. Новые варианты и возможные генотипы ВКЭ.
1.5.6. Географическое распределение генотипов.
1.6. Заключение

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы
2.1.2. Готовые коммерческие наборы
2.1.3. Буферы и основные растворы
2.1.4. Синтетические олигонуклеотиды
2.2. Медико-биологические образцы
2.2.1. Образцы крови больных
2.2.2. Иксодовые клещи
2.2.3. Штаммы ВКЭ
2.3. Методы
2.3.1. Выделение суммарных ДНК/РНК из иксодовых клещей
2.3.2. Выделение суммарных РНК методом фенольной депротеинизации
2.3.3. Выделение суммарных нуклеиновых кислот из крови пациентов
2.3.4. Обратная транскрипция
2.3.5. Выявление РНК ВКЭ методом полимеразной цепной реакции (ПЦР)
2.3.6. Электрофоретическая детекция продуктов ПЦР
2.3.7. Определение нуклеотидных последовательностей
2.3.8. Анализ нуклеотидных последовательностей
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Выявление и генотипирование ВКЭ из клинических образцов 68 крови пациентов
3.2. Анализ разнообразия штаммов ВКЭ, выделенных в природных 73 очагах Новосибирского научного центра и его окрестностях
3.2.1. Определение нуклеотидных последовательностей фрагментов гена Е
3.2.2. Анализ гомологии последовательностей
3.2.3. Исследование вариабельности “пептида слияния” белка Е
3.2.4. Молекулярно-генетический анализ последовательностей
3.3. Анализ разнообразия ВКЭ в индивидуальных иксодовых клещах
3.3.1. Выявление ВКЭ в клещах и определение нуклеотидных
последовательностей фрагментов генов Е и NS
3.3.2. Построение и анализ филогенетических деревьев
3.4. Типирование штаммов вируса клещевого энцефалита на 97 основании аминокислотных последовательностей
3.4.1. Анализ маркерных аминокислот
3.4.2. Сравнение подходов, основанных на анализе нуклеотидных и 98 аминокислотных последовательностей для типирования ВКЭ
3.4.3. Кластеронный анализ штаммов ВКЭ
3.5. Оценка возраста популяции ВКЭ на территории Новосибирского 103 Академгородка
3.5.1. Оценка гипотезы “молекулярных часов” и действия отбора
3.5.2. Оценка скорости молекулярной эволюции
3.5.3. Оценка времени дивергенции подгрупп ВКЭ сибирского генотипа на 106 территории Новосибирского Академгородка
3.6. Анализ генетических особенностей ВКЭ сибирского генотипа на
территории Новосибирского Академгородка и других территориях Евразии
3.6.1. Территория Урала
3.6.2. Территория Восточной Сибири
3.6.2.1. Анализ штаммов сибирского генотипа ВКЭ
3.6.2.2. Анализ штаммов ВКЭ “группы 886-84”
3.6.3. Северо-Западная часть Евразии (Скандинавия, Прибалтика, Северо-
Западный федеральный округ России)
3.6.4. Европейская часть России
3.6.5. Анализ генетической вариабельности сибирского генотипа ВКЭ
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА
Приложение 1
Приложение 2
лидерными последовательностями для структурных белков С и М, соответственно, и, по всей видимости, определяют транспортировку полипептидов внутри клетки, правильность сборки и созревания вириона.
Полипептид 2К образуется в результате процессинга белков NS4A и NS4B. Его последовательность практически одинакова у большинства известных вирусов комплекса клещевого энцефалита, и только для вирусов Алькхурма и киасанурской лесной болезни показаны множественные аминокислотные замены в нем [Локтев и др., 2007]. Было показано, что мутация V9M в 2К-полипептиде ВЗН обеспечивает устойчивость к ликорину, ингибирующему развитие инфекции в клетках, а также приводит к образованию вируса, устойчивого к индуцируемой интерфероном 2',5'-олнгоаденилат-синтетазе lb (Oaslb), которая ингибирует развитие инфекции вируса путем предотвращения накопления вирусной РНК в клетке [Zou et al., 2009а; Mertens et al., 2010]. Также, было показано, что интермедиат полипетида 2К и белка NS2B существенно усиливает индукцию иммунномедиаторов белком NS4B вируса Денге, играя синергическую роль для него [Kelley et al., 2011]. В экспериментах по суперинфекционному исключению (под суперинфекцией понимается повторное заражение в условиях незавершившегося инфекционного процесса) с ВЗН было показано, что полипептид 2К способен участвовать в регуляции репликации, по всей видимости, путем взаимодействия с клеточными факторами хозяйской клетки [Zou et al., 2009b],
1.4. ТАКСОНОМИЯ ФЛАВИВИРУСОВ
В настоящее время, в семействе флавивирусов (Flaviviridae•), к которому относится вирус клещевого энцефалита, выделяют три рода: флавивирусы (Flavivirus), пестивирусы (Pestivirus) и гепацивирусы (Hepacivirus) [Fauquet et al., 2005; Fields Virology, 2006]. Представители рода флавивирусов существенно отличаются от других родов этого семейства [Fields Virology,