Разработка методов детекции нейрональных a7 никотиновых ацетилхолиновых рецепторов

• Автор: Шелухина, Ирина Валерьевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 130 с. : ил.

Содержание

1 Сшгсок сокращений

2 Введение

3 Обзор литературных данных

3.1 Никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (нАХР)

3.1.1 Строение нАХР

3.1.1.1 Экстрацеллюлярный домен

3.1.1.1.1 АХ-связывающие белки - модель экстрацеллюлярного домена

3.1.1.1.2 Участки связывания лигандов

3.1.1.2 Трансмембранный домен

3.1.1.3 Внутриклеточный домен
3.1.2 Функционирование н АХР
3.1.3 Мышечный щи нАХР
3.1.4 Нейрональный тип нАХР
3.1.4.1 Особенности а7-субъединицы нАХР
3.1.4.2 Распространение а7 нАХР
3.1.4.2.1 В нервной системе
3.1.4.2.2 Вне нервной системы
3.1.4.3 Связь а7 нАХР с заболеваниями
3.1.4.3.1 Шизофрения
3.1.4.3.2 Болезнь Альцгеймера
3.1.5 Детекция нАХР
3.1.5.1 Использование антител
3.1.5.1.1 Иммуногенность различных участков нАХР
3.1.5.1.2 Антитела, полученные на рецептор
3.1.5.1.3 Антитела, полученные на бактериально экспрессированные
домены нАХР
3.1.5.1.4 Антитела, полученные на синтетические петиды
3.1.5.1.5 Примеры использования антител для исследований
3.1.5.1.6 Характеристика специфичности антител
3.1.5.2 Использование токсинов

3.1.5.2.1 а-Конотоксины
3.1.5.2.2 а-Нейротоксины длинного типа
4 Материалы и методы
4.1 Синтетические пептиды
4.2 Поликлональные антитела
4.3 Производные а-кобратоксина (СТХ)
4.4 Объекты исследований:
4.5 Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА)
4.6 Твердофазный анализ с использованием биот-СТХ
4.7 Вестерн-блоттинг
4.7.1 Поликлональные антитела
4.7.1.1 Антигены: экстрацеллюлярный домен а7(7—208) и мембраны
электрического органа ската Т. саШогпіса
4.7.1.2 Антигены: экстрацеллюлярный домен а7(8-208), гомогенаты и
мембранные препараты нервной ткани
4.7.2 Биотингошрованный а-кобратоксин (биот-СТХ)
4.8 Радиолигандный анализ
4.8.1 Прямое связывание
4.8.2 Конкурентное связывание
4.9 «Флуоресцентный»......................анализ конкурентного связывания
4.10 Генотипирование
4.11 Гистохимическое окрашивание
4.11.1 Окрашивание фиксированных срезов с использованием антител
4.11.2 Окрашивание парафинизированных срезов с использованием антител.
4.11.3 Окрашивание фиксированных и парафинизированных срезов с
использованием биот-СТХ
4.11.4 Окрашивание криостатных срезов с использованием антител и биот-

4.11.5 Окрашивание криостатных срезов с использованием антител и Аіеха-

4.11.5.1 Подготовка тканей
4.11.5.1.1 Свежезамороженная ткань
4.11.5.1.2 Фиксированная ткань
4.11.5.2 Гистохимическое окрашивание
4.12 Математическая обработка данных
4.13 Анализ гомологии
4.14 Построение модели пространственной структуры экстрацеллюлярного
домена нАХР
5 Результаты и обсуждение
5.1 Исследования с использованием антител
5.1.1 Получение поликлональных антител
5.1.2 Тестирование антител на «модельных системах»
5.1.3 Тестирование антител с использованием природных объектов
5.2, Исследования с использованием токсинов
5.2.1 Йодированный
5.2.2 Биотинилированный СТХ
5.2.3 Флуоресцентно-меченый аЕ^
5.2.3.1 Метод гистохимической детекции
5.2.3.2 Применение флуоресцентно-меченого аЕ^ для гистохимической
детекции а7 нАХР
5.2.3.2.1 Спинномо зговые ганглии
5.2.3.2.2 Характеристика а7 нАХР-экспрессиругощих нейронов
спинномозговых ганглиев
5.2.3.2.3 Нейроны каких функциональных подтипов экспрессируют а
нАХР?
5.2.3.2.4 Аксональный транспорт а7 нАХР
6 Выводы
7 Литература

Очень часто при иммунизации нативным рецептором антитела не реагируют с денатурированными белками [85, 227], антитела же на экспрессированные домены обычно эффективно узнают белки при Вестерн-блотгинге [85, 240].
3.1.5.1.4 Антитела, полученные на синтетические пептиды
Безусловным плюсом иммунизации животных синтетическими пептидами является возможность получения и аффинной очистки антител против заранее заданных аминокислотных последовательностей. В работе Zoli М. et al. был получен ряд аффинно-очищенных антител против синтетических фрагментов цитоплазматической петли а2, аЗ, а4, а5, аб, ß2, ß3 и р4-субъединиц нАХР (табл. 2), с использованием которых были иммунопреципитированы соответсвующие субъединицы из солюбилизатов мозга мышей [234]. Эффективность иммунопрециггатации была подтверждена с использованием тканей нокаутных мышей [234].
Однако иммунизация участками последовательности белка, исключёнными из их структурного окружения, должна применяться с большой осторожностью, т.к. остаётся неясным, насколько адекватно антитела на синтетические пептиды способны распознавать структуру нативного рецептора, где большинство эпитопов образованы прерывистыми последовательностями. Короткая аминокислотная последовательность, скорее всего, не сможет воспроизвести необходимую для взаимодействия структурную композицию. Более протяжённые пептиды с большей вероятностью будут содержать важные для белок-белковых взаимодействий остатки, но, с другой стороны, в растворе они могут принимать не нативную вторичную структуру, что также приведёт к-ложноотрицательным результатам.
Одним из возможных путей решения данной проблемы является комбинирование двух подходов: иммунизацию проводят бактериально экспрессированными доменами, а затем аффинно выделяют антитела на колонке, модифицированной конкретными пептидами. В качестве примера использования такого подхода можно привести получение антител на экспрессированные в E. coli экстрацеллюлярные домены а2, аЗ, а4, а5, аб, ß2, ß3, ß4-субъедншщ нАХР с последующей аффинной очисткой антител на колонке с пептидами, содержащими аминокислотные остатки 68-81 субъединиц. Полученные антитела избирательно реагировали с соответствующими экстрацеллюлярными доменами и пептидами при Вестерн-блотгинге. Специфичность антител к аЗ, а4, ß2 была