Кристаллизация и структурные исследования компонентов бокового "L12-выступа" большой рибосомной субчастицы

• Автор: Кравченко, Олеся Васильевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 100 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Рибосомные белки бактериального Ь7/Ь 12-выступа

1.1.1. Белок Ь7/Ы2

1.1.2. Белок Ы0

1.2. Рибосомные белки эукариотического Р1 /Р2-выступа

1.3. Рибосомные белки архейного Ь12-выступа

1.4. Комплекс Ь10-1., 12 и его стехиометрия

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Материалы
2.1.1. Химические материалы 3
2.1.1.1. Реактивы и ферменты
2.1.1.2. Буферы
2.1.1.3. Питательные среды 3
2.1.2. Биологические материалы
2.1.2.1. Бактериальные штаммы
2.1.2.2. Плазмиды
2.1.3. Принадлежности
2.1.4. Приборы
2.2. Методы
2.2.1. Методы генной инженерии 3
2.2.1.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле
2.2.1.2. Полимеразная цепная реакция
2.2.1.3. Обработка фрагментов ДНК сайт-специфическими
эндонуклеазами рестрикции
2.2.1.4. Очистка фрагментов ДНК
2.2.1.5. Лигирование фрагментов ДНК
2.2.1.6. Получение компетентных клеток Е. соИ
2.2.1.7. Трансформация компетентных клеток Е. соИ плазмидной ДНК
2.2.1.8. Анализ клонов методом ПЦР
2.2.1.9. Выделение плазмидной ДНК из небольших объемов культуры
2.2.1.10. Экспрессия рекомбинантного гена белков белков М]а1Л0МТ1;1,
МзаЫ0>ЛТ2, М]аЫ0, МЛЫО, МЛЫ0-Ы2

2.2.1.11. Экспрессия рекомбинантного гена белка MthL12
2.2.1.12. Экспрессия гена белка MjaLlONTF 1 для получения белка с заменой метионинов на селенометионины
2.2.2. Биохимические методы при работе с белками
2.2.2.1. Выделение MjaLlONTFl и MjaL10NTF2, MthL12, MjaLlO, MthLlO, MthL10-MthL12, MjaL10-MthL12
2.2.2.2. Методы хроматографической очистки белков MjaLlONTFl и MjaL10NTF2
2.2.2.2.1. Гидрофобная хроматография на колонке Butyl-Sepharose FF
2.2.2.2.2. Аффинная хроматография на колонке с сорбентом Heparine-Sepharose
2.2.2.2.3. Гель-фильтрация на колонке Superdex G75
2.2.2.3. Методы хроматографической очистки MthL12
2.2.2.3.1. Гидрофобная хроматография на колонке Butyl-Sepharose FF
2.2.2.3.2. Ионообменная хроматография на колонке с сорбентом Q-Sepharose
2.2.2.3.3. Ионообменная хроматография на колонке с сорбентом CM-Sepharose
2.2.2.3.4. Гель-фильтрация на колонке Superdex G75
2.2.2.4. Методы хроматографической очистки MthLlO и MjaLlO
2.2.2.4.1. Гидрофобная хроматография на колонке Butyl-Sepharose FF
2.2.2.4.2. Ионообменная хроматография на колонке с сорбентом Q-Sepharose
2.2.2.4.3. Гель-фильтрация на колонке Superdex G75
2.2.2.5. Методы хроматографической очистки MthL10-MthL12, MjaL10-MthL12
2.2.2.5.1. Г идрофобная хроматография-на колонке Butyl-Sepharose FF
2.2.2.5.2. Аффинная хроматография на колонке с сорбентом Heparine-Sepharose
2.2.2.5.3. Ионообменная хроматография на колонке с сорбентом Q-Sepharose
2.2.2.5.4. Гель-фильтрация на колонке Superdex 200
2.2.2.6. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях
222.1. Электрофорез в ПААГ в неденатурирующих условиях
2.2.2.8. Формирование комплекса L10-L12 из изолированных белков
2.2.2.9. Аналитическое ультрацентрифугирование
2.2.3. Биохимические методы при работе с РНК
2.2.3.1. Получение РНК-белковых комплексов
2.2.3.2. Электрофорез РНК, РНК-белковых и белок-белковых комплексов
в ПААГ в неденатурирующих условиях
2.2.4. Кристаллизация белков
2.2.5. Кристаллографичекие методы.
2.2.5.1. Съемка и обработка дифракционных данных

2.2.5.2. Анализ содержания ячейки
2.2.5.3. Решение проблемы фаз
2.2.5.4. Уточнение структуры
2.2.5.5. Проверка стереохимии
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Кристаллизация и структурные исследования Ы-концевого
фрагмента рибосомного белка К^аЫ0
3.1.1. Получение стабильного фрагмента белка Ы 0 из М. /аппазскИ
3.1.2. Определение аминокислотной последовательности М]аЬ1 ОМ'ГЕ
3.1.3. Создание генетических конструкций генов белков муаЫОШП и М]аЫ0МТЕ2
3.1.4. Выделение белков ЬДаЫОЫТП и М]аЫ014ТЕ2
3.1.5. Хроматографическая очистка белка М]аЕ10ЬПТТ
3.1.6. Хроматографическая очистка белка М)аЫ0ЫТЕ2
3.1.7. Кристаллизация белков КДа Ы0 КТЬ 1 и М]а 1.10 ЬПТ 2
3.1.8. Выделение и кристаллизация селеиометионинового
производного белка М)аЫ0МТЕ1
3.1.9. Пространственная структура М]аЫ0ЫТГ
3.1.10. Сравнение структуры первого домена М|аЫ0МТЕ со
структурами РНК-связывающих доменов в 'ГтаЫО и НтаЫО
3.1.11. Сравнение структуры (УЦаЫОМТР со структурой Р0 из Р. копкояки
в комплексе И-концевыми доменами белка Е12
3.1.12. Встраивание структуры М^аЫОШТ в модели архейной и бактериальной рибосомы
3.2. Исследование стехиометрии комплекса Ь10-Ь 12
3.2.1. Архейный комплекс Ы0-Ы2
3.2.2. Бактериальный комплекс Ы0-Ы2
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
БЛАГОДАРНОСТИ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
2.1. Материалы
2.1.1. Химические материалы
2.1.1.1. Реактивы и ферменты
В работе использовались следующие химические реактивы:
BioRad (США): агароза, додецилсульфат натрия;
Fluka (Швейцария): бромистый отидий, ссленометионин;
GERBU: агар, дрожжевой экстракт, триптон, глицин, хлорид натрия, хлорид магния, акриламид, ИДТ-метилен-бис-акриламид;
Fermentas (Литва): Т4 ДНК-лигаза;
Merck (Германия): хлорид кальция, хлорид марганца, хлорид калия, гидроксид натрия, тетрациклин, KOD Hoi Start ДНК-полимераза;
Reanal (Венгрия): бромфеноловый синий, р-аланин, ТЕМЕД, сахароза;
Serva (Германия): ЭДТА, кумасси G250, сульфат аммония, персульфат аммония, ксиленцианол, метиленовый синий, PMSF, p-меркаптоэтанол, хлорид железа, витамины;
Sigma (США): трис(гидроксиметил)-аминометан, ДТТ, Pipes, диметилсульфоксид, БСА, аминокислоты, ацетат калия, белковые маркеры;
Takara (Япония): ИПТГ;
Биохимик (Россия): канамицин, ампициллин;
СибЭнзим (Россия): ДНК-маркеры, Taq ДНК-полимераза, сайт-специфические эндонуклеазы рестрикции BamHI, FauNDI, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты;
Синтол (Россия): синтетические олигонуклеотиды-праймеры;
Реахим (Россия): этанол, сульфат магния, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный, хлорид аммония, глюкоза, борная кислота;
Химмед (Россия): “ледяная” уксусная кислота, соляная кислота;
Хроматографические носители: Heparine-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Швеция), Superdex G75 (Pharmacia, Швеция), Butyl-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Швеция);
2.1.1.2. Буферы
Буфер ТАЕ: 40 мМ трис-ацетат; 0.2 мМ ЭДТА, pH 8.0.
Буфер ТВ: 10 мМ Pipes; 15 мМ СаС12; 250 мМ КС1; 55 мМ МпС12.
Буфер ТКМ: 40 мМ трис-НС1, pH 7.5; 50 мМ NH4C1; 30 мМ КС1; 5 мМ MgCl2;
0.5 мМ ДТТ.
Буфер А: 100 мМ трис-НС1, pH 7.0; 100 мМ MgCl2; 1 М NaCl; 1 мМ ДТТ.
Буфер В: 100 мМ трис-НС1, pH 7.0; 1 М NaCl; 1.7 М SA; 1 мМ ДТТ.