Клонирование и экспрессия генов литических эндопептидаз L1 и L5 Lysobacter sp. XL1

• Автор: Лаптева, Юлия Сергеевна
• Шифр специальности: 03.01.03
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Бактериолитические ферменты
1.2. Классификация пептидаз
1.3. Сериновые протеазы
1.4. Структурная организация протеаз
1.5. Литические протеазы Lysobacter enzymogenes
1.6. Структурная организация а-литической протеазы Lysobacter enzymogenes
1.7. Секреция протеаз
1.7.1 Внеклеточные протеазы микроорганизмов, I (Т1SS) тип секреции и ABC
транспортеры
1.7.2 ABC транспортеры
1.7.3 Внеклеточные протеазы микроорганизмов и II (T2SS) тип секреции
1.7.4 Внеклеточные протеазы микроорганизмов V тип секркции (T5SS)
1.7.5 Секреция при помощи везикул
1.8. Регуляция экспрессии генов микробных сериновых протеаз
1.9. Системы экспрессии для наработки рекомбинантных белков
1.10. Продукция рекомбинантных белков в бактериях рода Pseudomonas
1.11. Бактерии рода Lysobacter
1.12. “Лизоамидаза” - препарат, получаемый на основе культуральной жидкости бактерии Lysobacter sp
1.13. Эндопептидазы L1 и L5 Lysobacter sp
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.1.1. Штаммы бактерий
2.1.2. Плазмидные вектора и рекомбинантные плазмиды
2.1.3. Среды и основные буферы
2.1.4. Реактивы
2.1.5. Олигонулеотидные праймеры
2.2. Методы исследования
2.2.1. Выделение хромосомной ДНК бактерий
2.2.2. Обработка ДНК эндонуклеазами рестрикции

2.2.3. ДНК-ДНК гибридизация по Саузерну
2.2.4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
2.2.5. Препаративное выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей
2.2.6. Лигирование фрагментов ДНК
2.2.7. Определение нуклеотидной последовательности
2.2.8. Получение компетентных клеток E.coli и трансформация
2.2.9. Получение электрокомпетентных клеток бактерий рода Pseudomonas и
электропорация
2.2.10. Конъюгативный перенос плазмид
2.2.11. Выделение плазмидной ДНК
2.2.12. Анализ рекомбинантных клонов на наличие вставки в плазмиде
2.2.13. Экспрессия ОРС alpA и alp В в E.coli и анализ литической активности
2.2.14. Анализ бактериолитической активности рекомбинантных штаммов
Pseudomonas на индикаторной среде
2.2.15. Культивирование Pseudomonas в жидких средах
2.2.16. Анализ аминокислотных последовательностей
2.2.17. Выделение РНК из клеток
2.2.18. Электрофорез РНК в геле, содержащим формальдегид
2.2.19. РНК-ДНК гибридизация
2.2.20. Определение стартовых точек транскрипции генов методом 5'-RACE
2.2.21. Приготовление агарозных блок- вставок с интактной ДНК бактерий
2.2.22. Обработка блок-вставок с ДНК эндонуклеазами рестрикции
2.2.23. Электрофорез в пульсирующих полях
2.2.24. Скрининг плазмид по методу Экхардта
2.2.25. Электрофорез в полиакриламидном геле
2.2.26. Иммуноблоттинг
2.2.27. Измерение бактериолитической активности
ГЛАВА III. Результаты и их обсуждение
3.1. Поиск и определение нуклеотидной последовательности участка ДНК
Lysobacter sp. XL1, кодирующего литические эндопептидазы L1 и L5
3.2. AlpA и А1рВ являются секретируемыми литическими протеазами
3.3. Обнаруженные гены alpA и alpB кодируют функционально активные
литические ферменты
3.4. ОРС alpA и alpB транскрибируются с собственных промоторов
3.5. Определение стартовых точек транскрипции

3.6. Определение локализации генов alpA и alp В Lysobacter sp
3.6.1. Детекция плазмид в клетках по модифицированному методу Экхардта
3.6.2. Анализ генома Lysobacter sp. XL1 при помощи электрофореза в
пульсирующих полях
3.7. Продукция рекомбинантных эндопептидаз AlpA и А1рВ в клетках бактерий
рода Pseudomonas
3.7.1. Конструирование системы экспрессии
3.7.2. Отбор штаммов бактерий рода Pseudomonas
3.7.3. Анализ бактериолитической активности штаммов псевдомонад
3.7.4. Спектр устойчивости штаммов Pseudomonas к антибиотикам
3.7.5. Анализ спектра секретируемых белков
3.8. Конструирование рекомбинантных штаммов для экспрессии генов alpA и alpB
в Pseudomonas
3.9. Анализ эффективности системы экспрессии
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ПРИЛОЖЕНИЕ

функциональная активность (растворимость и правильное сворачивание), безопасность, а также скорость продукции и выход белка.
Если получаемому препарату не требуются специфические пост-трансляционные модификации, то предпочтительнее использовать гетерологичные системы экспрессии на основе бактерий. Они наиболее доступные и простые в применении и позволяют получать продукт за более короткое время по сравнению с другими системами. Обычные цикл роста и времени экспрессии в бактериальной системе 1-2 дня, в то время как у дрожжей 5 дней, а у клеточных линий эукариот- 10-14 дней (Retallack et al., 2012).
Одной из первых бактерий, которую начали использовать для получения рекомбинантных белков, стала Escherichia coli. Простота и неприхотливость в культивировании данной бактерии привели к тому, что и на сегодняшний день эта система является наиболее используемой. Данная бактерия быстро растет, употребляет недорогие субстраты, позволяет нарабатывать большое количество белка. (Demain and Vaishnav, 2009). Разработаны коллекции специфических мутантных штаммов и плазмидных векторов, содержащих различные промоторы, довески (Tags), а также шапероны, для удобства наработки и очистки практически любых белков (Swartz, 2001; Mergulhao et al., 2005).
Было показано, что гетерологичная система экспрессии на основе E. coli позволяет получать также гликозилированные белки и белки с рядом других пост-трансляционных модификаций (N-концевое ацетилирование и ацетилирование боковых групп лизинов, фосфорилирование (Neumann et al., 2008).
Недостатки у системы экспрессии на основе E. coli есть, в принципе, как и любой другой системы. При достижении культурой высокой плотности в среде накапливается ацетат, который токсично действует на клетки, и они погибают. Этого можно избежать, контролируя уровень кислорода в системе и регулируя подачу глюкозы в среду культивирования (Wong et al., 2008). Многие белки оказываются в неактивных, нерастворимых формах, так называемых « тельцах включения», которые требуют дальней ренатурации, что тоже не всегда дает положительный результат. В ряде случаев эту проблему помогает решить понижение температуры культивирования. Также тяжело нарабатывать в E. coli белки с дисульфидными связями, так как во внутриклеточном пространстве они не образуются. В отличие от цитоплазмы, где поддерживаются восстановительные условия, периплазма клеток E. coli является компартментом с более окисленными условиями. Поэтому, нарабатываемый белок направляют в либо в периплазматическое пространство, либо во внеклеточную среду, сшивая