Изучение динамических и структурных свойств имуноглобулинов методом поляризации флуоресценции

• Автор: Дудич, Елена Ивановна
• Шифр специальности: 01.00.00
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1985
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 133 c. : ил

ВВЕДЕНИЕ ; . . . . ; . . , ;

Глава I." ОВДАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА СТРУКТУРЫ

ИММУНОГЛОБУЛИНОВ; . . . ;

§ 1*1; Классификация иммуноглобулинов

§ 1.2.' Первичная структура иммуноглобулинов « , ; . .

§ 1.3. Пространственная структура тп

иммуноглобулинов

§ 1.4. Конформация иммуноглобулинов в

растворе. Сегментальная гибкость; . ; ; 1<

Глава 2; ИЗМЕРЕНИЕ ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБЩЕЙ КОНФОРМАЦИИ И ДШАМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК БЕЛКОВ В РАСТВОРЕ.' ; ■; ; ■; .• ; ;' ; ■; ; . . .•
§ 2.1; Поляризация флуоресценции макромолекул в растворах;1 Закон Перрена . ; ; ; • ; . *: ;* ; ; ; ; ; •
§ 2.2; Применение флуоресцентной метки
для изучения общей конформации белков. Теория Вебера . ; . . . . •
§ 2.3. Критерии применимости теории
. Вебера. • ; V • .' • • . • ; •' •' • . ; с>и
§ 2;4; Импульсный метод поляризации
флуоресценции • ; • ; • • . . •
§ 2.5; Связь меаду импульсным и ста-ционарнам методами поляризации флуоресценции • . • • ; . ; • ; ; • • ;
§ 2.6. Применение метода поляризации
флуоресценции в исследовании структуры белков. . . . • . • • ; • • ;
Глава 3; МЕТОДИКА ИЗМЕБЕНЙЯ ДЛИТЕЛЬНОСТИ И
ДЕПОЛЯРИЗАЦИИ ФЛУОРЕСЦЕНЦИИ . . ; . ; ; ;
§ 3.1; Основы теории флуорометрических
измерений. ; • . . .' ; ; ; .- .' . . . •
§ 3.2. Фазовые флуорометры.
§ 3.3; йлпульсные флуорометры . . • ; . ; V ;

§ 3.4. Измерение степени поляризации флуоресценции при стационарном возбуждении
Глава 4. ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИХ
КОНЪЮГАТОВ С КРАСИТЕЛЕМ
§ 4.1. Выделение и очистка белков
§ 4,2. Наделение низкомолекулярных
белков из 3%G
§ 4.3. Выбор флуоресцентной метки
§ 4.4. Приготовление конъюгатов красителя
с белком. . . . . .
§ 4.5. Изменение соотношения Т/n. белковых
растворов
§ 4.6. Длительность возбужденного состояния дансила в конъюгатах с иммуноглобулинами. • •••••••••••••.•••
§ 4.7. Вычисление времени вращательной релаксации для молекул иммуноглобулинов и их фрагментов «•••••••••••
§ 4.8. Вспомогательные методы. ..«••..••
а. Аналитическое ультрацентрифугирование. . . • . . . ;
б. Метод спиновой метки. • . . . •
в. Метод радиоактивной метки
Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧЕСКОГО СВЯЗЫВАНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОГО ФАКТОРА С МОЛЕКУЛОЙ ИММУНОГЛОБУЛИНА G
§ 5.1. Исследование зависимости времени вращаг-тельной релаксации молекул йдб и их фрагментов от концентрации,
§ 5.2. Сравнительные исследования внтуримоле-кулярной подвижности ранних и поздних антител свиньи. .••••••••••••
§ 5.3. Выделение из молекул й§Ё нековалентно , связанных с ними низкомолекулярных
белков. .•.••«•••••.••••* <6
§ 5,4. Исследование молекул йдб с восстановленными и алкилированными дисульфид-ными связями

§ 5.5. Исследование зависимости времени вращательной релаксации 0т pH растворителя.
§ 5.6. Исследование методом аналитического ультрацентрифугирования диссоциации комплексов Здд с низкомалекулярными белками при разбавлении ..••••.••
§ 5.7. Изменение спектров ШР при диссоциации комплексов йдб с низкомолекулярными белками. •
§ 5.8. Выделение низкомолекулярных белков из радиоактивно-меченого человеческого йдВ , их фракционирование и исследование связывания с £с Пп
фрагментом
Глава 6. ОСВОБОЖДЕНИЕ НИЗКОМОДЕКУЛЯРНЫХ ФАКТОРОВ
ИЗ £сФРАШЕНТА КРОЛИКА ПРИ ОБРАЗОВАНИИ п„
ПРЕЦИПИТЙГШЩ КОМПЛЕКСОВ С АНТИГЕНОМ
§ 6.1. Фракционирование низкомолекулярных
белков, выделенных из йдб кролика
§ 6.2. Выделение комплексанта из ГсфрагментаЗ^б кролика
§ 6,3* Исследование освобождения КоГс-^С , из антител при образовании различного типа комплексов с антигеном
Глава 7. ГИБКОСТЬ СТРУКТУРЫ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ С,М,
А и Е ЧЕЛОВЕКА
§ 7.1. Сравнительное исследование различных подклассов миеломных иммуноглобулинов € человека методами поляризации флуоресценции и ЭПР
§ 7.2, Сравнительное исследование методами поляризации флуоресценции и ЭПР человеческих миеломных иммуноглобулинов А, М и Е. Наличие сегментальной подвижности
§ 7.3. Исследование миеломного УдА1 человека импульсным методом поляризации флуоресценции •••••••••••••
§ 7.4. Эволюция гибкости иммуноглобулинов
С и М различных животных
вывода

—Я —т
10" рад.сек." В нашей работе мы пользовались флуорометром, подробно описанным в работе Борисова и Думермана /77/. Стандартная ошибка измерения не превышала 0,1 не.
§ 3.3. Импульсные шлуорометры
Общая идея этих приборов заключается в том, что флуоресценция возбуждается кратковременными ( ~ 10“^ сек.) импульсами и фотоэлектрически регистрируется как форма возбуждающих импульсов L(t) > так и форма соответствующих импульсов флуоресценции Rit). При этом функции Ши Rit) связаны интегральным соотношением:
£[£)=jf L(i)Fli-T)olT /з-15
Для определения констант затухания флуоресценции и истинной формы кривой затухания суммарной интенсивности флуоресценции на ЭВМ методом моментов /49, 65, 78/ подбирают такую функцию Р(0 , которая лучше других приближает экспериментальную кривую £(■£). Обычно используют двухэкспоненциальное приближение, то есть P(-fc) представляют в виде суммы двух экспоненциальных членов:
F(£) = а£ е"±/<п+ a2Ê."t/r& /3-16
Решая интегральное уравнение /3 - 15/, методом моментов получают значения l, иПГ^. 'Затем снова вычисляется Л'Ш — свертка полученной функции F(-fc) с Ш)и оценивается среднеквадyZ.
ратичное 'отклонение дг расчетной кривой /С'Щоч экспериментальной И U) :
,гг.т- ешё/Ш , , т„,
А/ ^7 / 3 - 17/, где