Метод определения циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам и классам иммуноглобулинов

• Автор: Королевская, Лариса Борисовна
• Шифр специальности: 14.03.09
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Пермь
• Количество страниц: 127 с. : 2 ил.

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы. Иммунные комплексы, их свойства и методы идентификации

1.1. История вопроса

1.2. Образование иммунных комплексов, их биологические свойства

и процесс элиминации

1.2.1. Структура иммунных комплексов

1.2.2. Роль комплемента в удалении иммунных комплексов

1.2.3. Транспортная функция эритроцитов

1.2.4. Роль макрофагов в элиминации иммунных комплексов
1.3. Факторы, определяющие патогенные свойства циркулирующих
иммунных комплексов
1.3.1. Роль проницаемости сосудов
1.3.2. Влияние соотношения концентраций антигенов и антител
1.3.3. Роль изотипов иммуноглобулинов
1.3.4. Роль аффинности антител
1.3.5. Влияние заряда иммунных агрегатов
1.3.6. Роль размера иммунных комплексов
1.4. Патогенные эффекты, вызываемые иммунными комплексами
1.5. Методы определения иммунных комплексов
1.5.1. Иммунохимические методы
1.5.1.1. Комплемент-зависимые методы определения ЦИК
1.5.1.2. Методы, основанные на взаимодействии с СЗ
1.5.1.3. Бс-зависимые методы

1.5.2. Методы, основанные на биологических эффектах
1.5.3. Методы, основанные на физических свойствах иммунных комплексов
1.6. Свойства и механизм действия полиэтиленгликоля
1.6.1. Поведение иммунных комплексов в присутствии полиэтиленгликоля
1.6.2. Методы ПЭГ-преципитации для определения иммунных комплексов
1.7, Методы определения размеров иммунных комплексов
1.7.1. Основы теории светорассеяния
1.7.2. Спектротурбидиметрия как вариант метода светорассеяния
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Теоретические основы использования метода
спектротурбидиметрии в исследовании суспензий
2.1.1. Вопросы калибрования в спектротурбидиметрии
2.1.2. Спектротурбидиметрическое тестирование латексных частиц
2.2. Спектротурбидиметрия в оценке размеров модельных иммунных комплексов
2.2.1. Оценка эквивалентности соотношения антиген/антитело при образовании модельных иммунных комплексов
2.2.2. Определение размеров модельных иммунных комплексов
2.3. Исследование влияния различных концентраций ПЭГ-6000 на размеры модельных иммунных комплексов
2.4. Исследование сывороток крови
2.4.1. Выделение иммунных комплексов из сыворотки крови методом преципитации в ПЭГ-6
2.4.2. Определение концентраций иммуноглобулинов различных изотипов в выделенных ПЭГ-преципитатах
2.5. Оптимизация метода выделения иммунных комплексов

2.5.1. Исследование различных условий осаждения и отмывания иммунных комплексов в присутствии ПЭГ-6
2.5.2. Исследование влияния температурных режимов хранения образцов на концентрацию в составе ЦИК
2.6. Спектротурбидиметрия в определении размеров иммунных комплексов сывороток крови
2.7. Статистические методы
Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение
3.1. Стандартизация метода спектротурбидиметрии на основе суспензий частиц известного размера
3.1.1. Экспериментальное установление зависимости между диаметром латексных частиц и значением волнового экспонента.
3.2. Метод спектротурбидиметрии в оценке размеров модельных иммунных комплексов
3.2.1. Создание модельных иммунных комплексов; установление зоны эквивалентного соотношения антиген/антитело
3.2.2. Определение размеров модельных иммунных агрегатов
3.3. Оптические свойства ПЭГ-6000 в различных модельных системах
3.3.1. Исследование влияния ПЭГ различных концентраций на волновые экспоненты латексных частиц
3.3.2. Оптические свойства модельных иммунных комплексов в присутствии ПЭГ-6
3.4. Определение концентраций классов иммуноглобулинов в составе циркулирующих иммунных комплексов, дифференцированных по размерам
3.5. Оптические свойства сыворотки крови в присутствии ПЭГ
3.6. Оптимизация метода выделения иммунных комплексов
3.6.1. Изучение различных условий осаждения и отмывания

комплексах СЗ фрагменту комплемента [Lachmann, 1967]. Исследуемую сыворотку инкубируют с конглютинином, нанесенным на твердую фазу. Количество ИК в сыворотке определяют после добавления анти-IgG, меченных изотопом, либо ферментом. Метод относительно прост, специфичен и чувствителен, но позволяет определять только крупные комплемент-фиксирующие ИК.
Использование F(ab)2 анти-СЗ вместо конглютинина лежит в основе одноименного твердофазного теста [Muratsugu, 2005; Pereira et al., 1980] определения комплемент-содержащих ИК.
1.5.1.3. Fc-зависимые методы
К методам определения ИК несвязанных с их комплемент-фиксирующей активностью относят варианты тестов с ревматоидным фактором (РФ). РФ — это аутоантитела, обладающие специфичностью к Fc-фрагменту IgG человека [Eisenberg, 1976]. В основе методов лежит способность поликлонального или моноклонального РФ взаимодействовать с ИК. Поликлональные РФ — это IgM (и IgG) антитела, которые обладают высокой аффинностью к агрегированному IgG или IgG-содержащим ИК [Eisenberg, 1976]. Моноклональный РФ преципитирует ИК более эффективно, чем поликлональные РФ, и обычно присутствует в сыворотках больных ревматоидным артритом [Winchester et al., 1971]. Например, в одном варианте конкурентного радиоиммунного анализа используют моноклональный РФ, фиксированный на твердой поверхности, меченный агрегированный IgG и исследуемую сыворотку [Luthra et al., 1975]. В другом - меченный моноклональный РФ, IgG, связанный с сефарозой, и образец исследуемой сыворотки [Gabriel, Agnello, 1977]. ИК, присутствующие в изучаемых сыворотках, подавляют связывание IgG с РФ. Еще один вариант метода основан на способности ИК исследуемой сыворотки ингибировать вызванную РФ агглютинацию латексных частиц, покрытых IgG [Lurhuma et al., 1976]. Все эти тесты чувствительны и позволяют определять даже