РЕДОКС-ЗАВИСИМЫЕ МЕХАНИЗМЫ ИЗМЕНЕНИЙ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ СВОЙСТВ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ОСТРОМ ВОСПАЛЕНИИ И ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ

• Автор: Жаворонок, Татьяна Васильевна
• Шифр специальности: 14.03.03
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2012
• Место защиты: Томск
• Количество страниц: 323 с. : 4 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Современные представления о роли редокс-метаболизма в развитии окислительного стресса, дизрегуляции функций и апоптоза нейтрофилов при остром воспалении
1.1. Роль окислительного стресса в патогенезе острого воспаления
1.2. Кислород-зависимые механизмы цитотоксичности нейтрофилов как
эффекторных клеток острого воспаления
1.3. Механизмы окислительной модификации макромолекул клетки
свободными радикалами
1.3.1. Молекулярные мишени при окислительном повреждении клеточных мембран
1.3.2. Окислительная модификация белковых молекул клетки
1.4. Молекулярные механизмы антиоксидантной защиты клетки
1.4.1. Неферментативные антиоксиданты
1.4.2. Ферментативные антиоксиданты
1.5. Окислительная модификация белков и состояние тиолдисульфидной
системы при окислительном стрессе и остром воспалении
1.6. Редокс-состояние и программированная гибель клеток в патогенезе
острого воспаления
1.6.1. Современные представления о молекулярных механизмах реализации апоптоза
1.6.2. Молекулярные основы взаимодействия окислительного стресса и апоптоза: механизмы участия активных метаболитов кислорода
1.6.3. Роль программированной гибели нейтрофилов в реализации острого воспаления
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Характеристика клинического и экспериментального материала
2.1.1. Клиническая характеристика пациентов с диагнозом острый аппендицит
2.1.2. Клиническая характеристика пациентов с диагнозом внебольничная пневмония
2.1.3. Оценка развития окислительного стресса в организме при остром аппендиците и внебольничной пневмонии
2.2. Экспериментальный блок исследований in vitro
2.3. Методы исследования ,
2.3.1. Фракционирование венозной крови при подготовке
к исследованиям
2.3.1.1. Выделение и культивирование нейтрофилов крови
2.3.1.2. Выделение эритроцитов и получение мембран эритроцитов
2.3.1.3. Определение концентрации белка в нейтрофилах, взвеси мембран эритроцитов и плазме крови
2.3.2. Методы оценки функционального состояния нейтрофилов,
альвеолярно-капиллярной мембраны легких, процессов перекисного окисления липидов мембраны эритроцитов и плазмы крови
2.3.2.1. Оценка концентрации активных форм кислорода в нейтрофилах

2.3.2.2. Оценка продукции конечных метаболитов оксида азота нейтрофилами
2.3.2.3. Оценка продукции гидроксильного радикала нейтрофилами
2.3.2.4. Определение активности миелопероксидазы в нейтрофилах
2.3.2.5. Оценка продукции провоспалительных цитокинов нейтрофилами ’
2.3.2.6. Оценка альвеолярно-капиллярной проницаемости и вентиляционно-перфузионного соотношения легких
2.3.2.7. Оценка активности №+/К+-АТФазы в мембране эритроцитов
2.3.2.8. Определение содержания диеновых конъюгатов гидроперекисей липидов в мембране эритроцитов
2.3.2.9. Определение содержания ТБК-реактивных продуктов
в мембране эритроцитов и плазме крови
2.3.3. Методы оценки окислительной модификации белков и
антиоксидантной системы в нейтрофилах и плазме крови
2.3.3.1. Определение содержания восстановленного и окисленного глутатиона в нейтрофилах
2.3.3.2. Определение концентрации SH-групп белков и белково-связанного глутатиона в нейтрофилах
2.3.3.4. Определение активности глутатионпероксидазы в нейтрофилах
2.3.3.5. Определение активности тиоредоксинредуктазы в нейтрофилах
2.3.3.6. Определение содержания карбонильных производных белков
в нейтрофилах и плазме крови
2.3.3.7. Определение содержания битирозина и окисленного триптофана в плазме крови
2.3.3.8. Определение активности каталазы в плазме крови
2.3.3.9. Определение содержания церулоплазмина в плазме крови
2.3.4. Методы изучения апоптоза и внутриклеточных систем
вторичных мессенджеров нейтрофилов
2.3.4.1. Оценка содержания белков-регуляторов апоптоза (Вс1-2, Вах)
в нейтрофилах
2.3.4.2. Оценка реализации апоптоза нейтрофилов
2.3.4.3. Оценка содержания ионов кальция в цитоплазме нейтрофилов
2.3.4.4. Оценка содержания циклических нуклеотидов (цАМФ и цГМФ)
в нейтрофилах
2.4. Статистическая обработка результатов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Клинический блок исследования
3.1.1. Функциональное состояние нейтрофилов крови при остром воспалении
3.1.2. Перекисное окисление липидов и активность Ма+/К+-АТФазы мембраны эритроцитов и показатели состояния альвеолярнокапиллярной мембраны легких при остром воспалении
3.1.3. Оценка показателей перекисного окисления липидов, окислительной модификации белков и антиоксидантной системы плазмы крови при остром воспалении

3.1.4. Состояние тиолдисульфидной системы и окислительная модификация белков нейтрофилов крови при остром воспалении
3.1.5. Индукция апоптоза нейтрофилов крови при остром воспалении
3.2. Экспериментальный блок исследования
3.2.1. Сравнительная оценка функционального статуса, редокс-состояния тиолдисульфидной системы и индукции апоптоза нейтрофилов при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
3.2.1.1. Функциональный статус нейтрофильных лейкоцитов, состояние тиолдисульфидной системы и окислительной модификации белков нейтрофилов при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
3.2.1.2. Индукция программированной гибели нейтрофилов при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
3.2.2. Оценка молекулярных механизмов участия тиолдисульфидной системы в поддержании функционального статуса нейтрофилов и защите белков от окислительной модификации при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
3.2.2.1. Функциональное состояние нейтрофилов в условиях действия блокатора или протектора SH-групп, ингибитора синтеза глутатиона de novo или каталазы при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении ;
3.2.2.2. Состояние тиолдисульфидной системы нейтрофилов в условиях действия блокатора или протектора SH-групп, ингибиторов синтеза глутатиона de novo и каталазы при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении '
3.2.2.3. Окислительная модификация белков нейтрофилов в условиях действия блокатора или протектора SH-групп, ингибитора синтеза глутатиона de novo или каталазы при окислительном стрессе in vitro
и остром воспалении “
3.2.3 Оценка молекулярных механизмов участия оксида азота в
регуляции программы апоптоза нейтрофилов при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
3.2.3.1. Продукция активных форм кислорода и метаболитов оксида азота нейтрофилами в условиях действия индуктора или ингибитора NO-синтаз при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
3.2.3.2. Реализация программированной гибели и содержание белков-регуляторов апоптоза в нейтрофилах в условиях действия индуктора или ингибитора NO-синтаз при окислительном стрессе in vitro и остром воспалении
3.2.3.3. Состояние систем внутриклеточных мессенджеров (циклических нуклеотидов и ионов кальция) в нейтрофилах в условиях действия индуктора или ингибитора NO-синтаз при окислительном стрессе
in vitro и остром воспалении
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) [14и Ь., 2001]. Освободившийся N0 быстро диффундирует к гуанилатциклазе и другим мишеням [Волин М.С. и соавг., 1998;ХиЬ.е1ак, 1998; Напа1у КА е!ак, 2001; 11Щко¥8к1 К е! ак, 2007].
Высокая реакционноспособность N0 определяет наличие нескольких путей его утилизации, которые взаимно дополняют друг друга. К ним относят необратимое связывание с дезоксигенированной и оксигенированной формами гемоглобина, мочевой кислотой в просвете кровеносного сосуда [1ли X. е! а1., 1998], взаимодействие с Ог" в стенке кровеносного сосуда или лейкоцитах [Бип I. Щ а1., 2010], реакция с кислородом в цитоплазме клеток с последующим восстановлением до нитрит- и нитрат-ионов [ТШе]а N. й а1., 2004]. N0 расходуется в ферментативных превращениях: в качестве субстрата семейства пероксидаз [АЬи-Боиб КМ., Нагеп 8.Ь., 2000], на активацию или инактивацию ферментов путем нитрозилирования, что характерно для простагландин-Н синтазы [О'ОоппеП У.В. е! а1., 2000], Мп-СОД и рибонуклеотид-редуктазы [НапаГу К. А. 2001; Т^аК йа1., 2004].
В целом, комплекс реакций «генерации/утилизации» оксида азота представляет собой очень чувствительную систему, которая отвечает на многие происходящие в клетке изменения, используя всего два способа -зависимый и независимый от циклического 3’,5’-гуанозинмонофосфата (цГМФ). Учитывая это, ряд авторов предлагает делить все эффекты N0 на цГМФ-зависимые и цГМФ-независимые [ВгипеВ., 1999; Напа1у А.К., 2001; РпеЬе А., КоеэИ^ Э., 2003], что схематично представлено на рисунке 2.
Часть эффектов оксида азота определяют простые химические реакции, опосредованные активными формами (нитрит-, нитрат-ионы, N02, ион нитрозониума), которые получаются при его взаимодействии с Ог* или Ог-Подобные реакции, как правило, ведут к нитрозилированию и образованию нитрозоаминов, Б-нитрозотиолов, дезаминированию оснований ДНК [Винк ДА и соанг., 1998; ЯЩкошБк! Я. л ак, 2007; Бип 1. Щ ак, 2010]. Многие из этих реакций лежат в основе отрицательной роли N0 в клетке. Например, взаимодействуя с низкомолекулярными тиолами, он образует токсичные