Взаимосвязь качественного и количественного состава биоценозов ротовой полости и индивидуального генетического профиля на фоне воспалительных заболеваний пародонта

• Автор: Зорина, Оксана Александровна
• Шифр специальности: 14.01.14
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 226 с. : 31 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Микробиоценоз полости рта в норме и при ВЗП

1.2. Роль защитных факторов организма в патогенезе ВЗП

1.3. Молекулярно-генетические методы диагностики ВЗП

1.4. Генетические факторы в развитии заболеваний пародонта

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

, 2.1. Материал исследования

2.2. Клинические методы исследования
2.3. Рентгенологические методы исследования
2.4. Молекулярно-генетические методы исследования
2.4.1. Методика забора биоматериала
2.4.2. Экстракция нуклеиновых кислот
2.4.3. Выявление и определение количественного соотношения пародонтопатогенных бактерий полости рта
2.4.4. Генотипирование образцов геномной ДНК
2.5. Биохимические методы исследования
2.6. Методы комплексного лечения пациентов с ХГП
2.7. Методы статистического анализа
I 2.7.1. Статистическая обработка результатов молекулярно-генетического
исследования
' 2.7.2. Использованное программное обеспечение и базы данных.
2.7.3. Статистическая обработка результатов клинического исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЦЕНОЗОВ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ

3.1. СОЗДАНИЕ ПАНЕЛИ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ОЦЕНКИ КАЧЕСТВЕННОГО И КОЛИЧЕСТВЕННОГО СОСТАВА БИОЦЕНОЗОВ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ
3.1.1. Создание наборов реагентов для выявления и количественного определения ДНК пародонтопатогенных микроорганизмов методом полимеразной цепной реакции «в реальном времени»
3.1.1.1. Подбор последовательностей праймеров и флуоресцентномеченых проб
3.1.1.2. Оценка чувствительности и специфичности разработанных-тест-систем
3.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ СОСТАВА МИКРОБИОЦЕНОЗОВ РОТОВОЙ ПОЛОСТИ И СОСТОЯНИЯ ТКАНЕЙ ПАРОДОНТА
3.2.1. Нормировка данных при количественном исследовании пародонтопатогенной микрофлоры методом ПЦР «в реальном времени»
3.2.2. Частота выявления пародонтопатогенных микроорганизмов при разной степени тяжести пародонтита
3.2.3. Количественная оценка содержания патогенных представителей, микробиоценоза пародонтальных карманов при разной степени тяжести пародонтита
3.2.4. Профили относительного содержания микроорганизмов в процессе развития пародонтита и их роль в патогенезе заболевания
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ
4.1.1. Выбор подхода к определению генотипа методом ПЦР «в реальном
времени»
4.1.1.1. Разработка тест-систем на основе аллель-специфичной ПЦР

4.1.1.2. Разработка тест-системы на основе снятия кривых плавления с флуоресцентно-мечеными аллель-специфичными олигонуклеотидными
пробами после реакции
4.1.2. Создание панели тест-систем для определения генотипа человека
4.1.2.1. Подбор последовательностей праймеров и флуоресцентномеченых проб
4.1.2.2. Оценка чувствительности и специфичности разработанных тест-систем для генотипирования
4.2. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЗАИМОСВЯЗИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА И СОСТОЯНИЯ ТКАНЕЙЛАРОДОНТА
4.2.1. Взаимосвязь полиморфизма генов некоторых цитокинов с развитием заболеваний пародонта
4.2.2. Взаимосвязь полиморфизма генов ММР2 и ММР9 с развитием заболеваний пародонта
4.2.3. Взаимосвязь полиморфизма генов некоторых коллагенов с развитием заболеваний пародонта
4.2.4. Взаимосвязь состава биоценозов пародонтальных карманов и индивидуального генетического профиля со степенью тяжести пародонтита
ГЛАВА 5. РЕЗУЛЬТАТЫ КЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
5.1. ХАРАКТЕРИСТИКА СТОМАТОЛОГИЧЕСКОГО СТАТУСА ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМ ГЕНЕРАЛИЗОВАННЫМ ПАРОДОНТИТОМ
5.2. РЕЗУЛЬТАТЫ КОМПЛЕКСНОГО ЛЕЧЕНИЯ БОЛЬНЫХ ХГП С УЧЕТОМ ИНДИВИДУАЛЬНОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПРОФИЛЯ И СОСТОЯНИЯ МИКРОБИОЦЕНОЗА ПОЛОСТИ РТА

- циклический температурный режим: если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе амплификации с ней происходят события, обеспечиваемые определенными температурными циклами.
Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов:
1. Денатурация. На этом этапе происходит денатурация ДНК, находящейся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95°С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.
2. Отжиг (процесс присоединения праймеров к одноцепочечной ДНК-мишени). Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности, гласящим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив, аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина — цитозин. Сразу после отжига фермент Гад-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК, начиная с 3’— конца праймера.
3. Синтез (элонгация). На этом этапе для максимальной эффективности синтеза температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Гад-полимеразы, и синтез второй цепи ДНК продолжается.
В случаях близких значений температур отжига праймеров и оптимума работы фермента Гад-полимеразы становится возможным совместить стадии отжига и элонгации. Для получения количества ДНК, необходимого для идентификации, обычно требуется 30-50 циклов (в зависимости от эффективности реакции и количества стартового материала). Метод ПЦР отличается высокой чувствительностью и позволяет обнаружить присутствие в исследуемом образце даже единичных молекул ДНК [87].
ПЦР «в реальном времени»
Существует два типа регистрации результатов ПЦР: после
прохождения реакции и непосредственно в ходе ПЦР [99]. Более ранним способом является регистрация результатов после реакции, чаще всего с помощью электрофореза в агарозном геле. В последнее время широкое распространение получил метод регистрации результатов ПЦР во время