Идентификация внутриклеточных сигнальных путей и функций белков, модулирующих процессы метастазирования и опухолевой прогрессии

• Автор: Чевкина, Елена Максимовна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 294 с. : ил.

Оглавление
Введение

Глава 1. Материалы и Методы

1.1 Клеточные линии и условия культивирования

1.2 Образцы тканей

1.3 Выделение нуклеиновых кислот

1.3.1 Выделение плазмидной ДНК

1.3.2 Выделение РНК из клеточных культур и образцов тканей

1.3.3 Выделение фрагментов ДНК для клонирования

из агарозных гелей

1.4 Аналитический электрофорез ДНК в агарозных гелях

1.5 Молекулярное клонирование
1.5.1 Получение компетентных клеток Е. соН
1.5.2 Трансформация компетентных клеток Е.соП
1.5.3 Обработка ДНК рестрицирующими эндонуклеазами
1.5.4 Реакция лигирования
1.5.5 Клонирование кодирующей последовательности гена
с кДНК и получение экспрессирующих векторов
1.5.6 Клонирование предшественников малых шпилечных РНК
1.6 Обратная транскрипция РНК
1.7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
1.7.1 Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
1.7.2 ПЦР в реальном времени
1.8 Трансфекция и получение псевдовирусных частиц
1.9 Инфекция псевдовирусными частицами
1.10 Анализ белков
1.10.1 Приготовление клеточных лизатов
1.10.2 Приготовление лизатов из образцов тканей легкого
1.10.3 Электрофорез белков и Вестерн-блот гибридизация

1.10.4 Анализ активности фосфолипазы PLD
1.10.5 Анализ активности малой ГТФазы Ral
1.10.6 Приготовление образцов для определения ферментативной активности протеиназ внеклеточного матрикса
1.10.7 Анализ желатиназной активности
1.10.8 Анализ активности иРА
1.11 Исследование клеточных характеристик в культурах in vitro
1.11.1 Анализ динамики пролиферации
1.11.2 Анализ динамики пролиферации с использованием МТТ
1.11.3 Анализ подвижности методом «зарастания раны» in vitro (wound healing assay)
1.11.4 Анализ клоногенности (тест на образование колоний
в условиях разреженной популяции
1.11.5 Анализ способности к неприкрепленному росту (тест на образование колоний в полужидкой среде)
1.11.6 Анализ направленного движения
по градиенту концентрации факторов роста
1.11.7 Анализ инвазивной активности (тест на инвазию in vitro)
1.12 Исследование клеточных характеристик in vivo
1.12.1 Определение туморогенности и динамики роста опухолей
1.12.2 Определение экспериментальной (ЭМА)
и спонтанной (СМА) метастатической активности
1.13 Иммуногистохимический анализ (ИГХ)
1.14 Статистическая обработка результатов
1.15 Растворы, реагенты и среды

Глава 2. Анализ влияния онкогена H-Ras на метастатическую активность трансформированных фибробластов и идентификация H-Ras-зависимых сигнальных путей, обеспечивающих усиление метастатического потенциала
2.1. Состояние проблемы
2.2.Собственные результаты
2.2.1 Экспрессия активированного онкогена H-Ras увеличивает спонтанную метастатическую активность трансформированных фибробластов посредством активации H-Ras/RalGDS/Ral сигнального пути
2.2.2 Роль малой ГТФазы RalA в H-Ras-зависимой стимуляции метастатической активности клеток
2.2.3. Значение активации RalA в усилении метастатической активности фибробластов, трансформированных вирусом саркомы Рауса, спонтанно трансформированных фибробластов и трансформированных фибробластов, прошедших селекцию in vivo
2.3.0бсуждение результатов
Глава 3. Сравнение роли гомологичных белков RalA и RalB в приобретении трансформированными фибробластами
высоко-агрессивного фенотипа и метастатической активности
3.1 Состояние проблемы
3.2 Собственные результаты
3.2.1 RalB в большей степени, чем RalA, стимулирует спонтанную метастатическую активность трансформированных фибробластов
3.2.2 Совместная экспрессия белков RalA и RalB не приводит к дополнительному усилению метастатической активности

помощью штангенциркуля раз в 5 дней, начиная с 14 дня после введения клеток на протяжении 8 недель. Контрольное измерение проводили при вскрытии животных.
1.12.2 Определение экспериментальной (ЭМА) и спонтанной (СМА)
метастатической активности
Метастатическую активность исследуемых клеточных линий оценивали путём подсчета количества лёгочных метастазов, возникающих после внутривенного (ЭМА) или подкожного (СМА) введения исследуемых клеток сирийским хомякам (МевоспсеШБ аигайш). Для определения ЭМА 1 мл суспензии, содержащей 1105 клеток (приводится среднее значение, количество клеток для каждой конкретной культуры указано в тексте) в среде ЭМЕМ вводился внутривенно (внутриорбитально). Животных усыпляли и вскрывали через 30 суток после инъекции. Для определения СМА клетки разводили в среде ЭМЕМ до концентрации 2-104 (приводится среднее значение, количество клеток для каждой конкретной культуры указано в тексте) клеток в 0,5 мл и в виде суспензии в ЭМЕМ вводили сирийским хомякам подкожно в область спины, между передними лапками. Клетки каждой исследованной линии вводили группе из 10 хомяков в 3-х независимых повторах. По прошествии 8 недель животных усыпляли и вскрывали. Процедура обсчета метастазов менялась с течением времени для разных серий экспериментов, что обсуждается в тексте. В большинстве случаев проводилось гистологическое исследование образцов легких и опухолей при участии вед. н.с. отдела канцерогенных веществ РОНЦ РАМН к.м.н. Л.С. Трухановой. Для этого ткань фиксировали в 10% нейтральном формалине, после обезвоживания в спиртах заливали в парафиновые блоки и готовили ультратонкие серийные срезы толщиной 5-6 мкм. Для общего обзора гистологических препаратов применяли окраску срезов гематоксилином и эозином. СМА рассчитывали как среднее количество метастазов на 90 срезов легких животных из одной группы. Размер метастазов оценивался гистологически по трехбалльной шкале (1- крупный макрометастаз, 2-средний метастаз, 3 - микрометастаз, состоящий из нескольких клеток).
1.13 Иммупогистохшшческий анализ
Для ИГХ исследования использовали послеоперационный материал от 27 больных с диагнозом «монофазная синовиальная саркома», предоставленный архивом Отдела патологической анатомии опухолей человека НИИ клинической онкологии РОНЦ им.
Н.Н.Блохина РАМН. Образцы опухолевой и условно нормальных тканей фиксировали в забуференном формалине в течение 24 часов, после обезвоживания в спиртах фрагменты тканей заливали в парафиновые блоки, с которых делали ультратонкие серийные срезы. Депарафинизированные срезы обрабатывали в цитратном буфере (pH 6,0) в водяной бане при