Оптимизация технологии и стандартизация получения противоопухолевых вакцин на основе аутологичных дендритных клеток.

• Автор: Нехаева, Татьяна Леонидовна
• Шифр специальности: 14.01.12
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 137 с. : 37 ил.

Оглавление
Введение
Глава

Дендритные клетки (ДК) и их роль в противоопухолевом иммунитете

(обзор литературы)

1.1. Фенотипическая и функциональная гетерогенность ДК

1.2. Миелоидные ДК: иммунофенотип и функциональная активность

1.3. Миелоидные ДК и противоопухолевый иммунный ответ

1.4. Миелоидные ДК и противоопухолевая вакцинотерапия

1.5. Требования надлежащей лабораторной практики (СЬР) в получении

противоопухолевых дендритноклеточных вакцин

Глава
Материалы и методы исследования
2.1. Материалы
2.2. Методы
2.2.1. Получение костномозговых и периферических дендритных клеток
2.2.2. Дифференцировка дендритных клеток из миелоидных предшественников ех уАо35
2.2.3. Приготовление опухолевого лизата, содержащего раково-тестикулярные антигены
2.2.4. Крноконсервация миелоидных предшественников и вакцинных дендритных клеток
2.2.5. Размораживание миелоидных предшественников и вакцинных дендритных клеток
2.2.6. Оценка количества и жизнеспособности (миелоидных предшественников, вакцинных дендритных клеток, мононуклеаров, опухолевых клеток)
2.2.7. Иммуноцитохимичсская характеристика дендритных клеток
2.2.8. Иммунофенотипнческий анализ миелоидных предшественников, вакцинных дендритных клеток, опухолевых клеток
2.2.9. Мониторинг специфического поствакцинального иммунного ответа (ЕПврФ анализ)
2.2.10. Оценка поствакцинального гуморального иммунного ответа
(клеточный ИФА)
Глава
Стандартизация методов получения и криоконсервации миелоидных предшественников ДК из лейкаферезного материала и периферической крови
3.1. Стандартизация оптимальных условий выделения МНК и моноцитов из
лейкаферезного материала и периферической крови

3.2. Стандартизация оптимальных условий криоконсервации МНК и моноцитов из лейкаферезного материала и периферической крови
Глава
Оптимизация и стандартизация условий дифференцировки вакцинных ДК
4.1. Изучение влияния ростового фактора GM-CSF импортного (GM-CSF1) и отечественного (GM-CSF2) производства на дифференцировку ДК in vitro
4.2. Изучение влияния различных концентраций IL-4 па дифференцировку ДК in vitro
4.3. Изучение влияния IFN-a на дифференцировку ДК in vitro
4.4. Изучение влияния питательных сред на дифференцировку и созревание ДК
4.4.1. Оценка иммунофенотипа ДК, дифференцированных на различных питательных средах: контроль качества
Глава
Оптимизация и стандартизация условий нагрузки и активации ДК
5.1. Характеристика клеточных линий меланомы кожи человека, экспрессирующих РТА
5.2. Нагрузка и активация незрелых CD14'CDla+CD83' ДК
5.3. Оценка дифференцировки ДК по уровню экспрессии иммунофенотипических маркеров на разных стадиях созревания ДК
Глава
Стандартизация условий криоконсервации и хранения вакцинных ДК в соответствии с иммунофенотипом, требованиями надлежащей лабораторной и клинической практики
6.1. Оценка жизнеспособности ДК до и после криоконсервации в ультранизких температурах
6.2. Продолжительное хранение криоконсервированной дендритноклсточной вакцины: контроль качества
6.3. Оценка возможности использования бессывороточной среды для криоконсервации и хранения ДК
6.4. Оценка функциональной активности криоконсервированных вакцинных ДК
6.5. Скрининг вакцинного препарата ДК на наличие инфекционных агентов: контроль качества
6.6. Организация лаборатории длительного хранения криоконсервированных дендритноклеточных вакцин (криогенная лаборатория)
Глава
Активная специфическая иммунотерапия (вакцинотерапия) аутологичными костномозговыми и периферическими ДК больных диссеминированной меланомой кожи
7.1. Оценка безопасности вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками
7.2. Оценка клинической эффективности вакцинотерапии аутологичными дендритными клетками
7.3. Оценка иммунологической эффективности терапии
7.3.1. Оценка реакций ГЗТ у больных на фоне терапии ДКВ
7.3.2. Оценка содержания субпопуляций лимфоцитов у больных, получавших лечение аутологичными ДК
7.3.3. Оценка специфического иммунного ответа
Глава
Обсуждение результатов исследования
Выводы
Литература
Приложения

Рис. 4. Лейкаферез миелоидных предшественников ДК с использованием системы Cobe Spectra (А). Использование цветовой шкалы для контроля качества лейкаферезного продукта (Б).
2.2.2. Дифференцировка дендритных клеток из миелоидных предшественников in vitro
Методика приготовления вакцины на основе аутологичных ДК, нагруженных РТА+ опухолевым лизатом, представлена на рис. 5.
> 'і;»/-;.::«'
VV ґ*лл‘А.гг
Опухолевый РТА+лизат
Ґ “
к * < <т % xJS)
CD83+ зрелые ДК
І Ізіап

миелоидные
предшественники
Дифференцировка ДК | I CD1 а+ незрелые ДК
Рис. 5. Приготовление вакцины на основе аутологичных ДК, нагруженных РТА+ лизатом.