Разработка модели экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмы для изучения новых подходов к аллерген-специфической иммунотерапии

• Автор: Литвин, Лолиана Стефановна
• Шифр специальности: 14.00.36
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 138 с. : 18 ил.

Перечень условных сокращений:

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Экспериментальные модели бронхиальной астмы (БА) у животных

1.2 Моделирование бронхиальной астмы у мышей

1.2.1 Краткосрочные модели БА

1.2.2 Долгосрочные модели БА

1.3 Практическое применение моделей БА на мышах

1.3.1 Изучение патогенеза БА

1.3.2 Использование моделей БА на мышах для доклинических исследований фармакологических препаратов
1.3.3 Изучение механизмов аллерген-специфической иммунотерапии (АСИТ) и исследование новых форм лечебных аллергенов

Глава 2 Материалы и методы

2.1 Лабораторные животные
2.2 Аллергены и основные реагенты, использованные в работе
2.3 Способы и схемы иммунизаций животных
2.4 Определение аллерген-специфического IgE методом пассивной кожной анафилаксии
2.5 Твердофазный непрямой иммуноферментный анализ (ИФА)
2.6 Оценка системной анафилаксии у мышей с экспериментальной IgE-зависимой бронхиальной астмой (ЭБА) и после экспериментальной АСИТ (ЭАСИТ)
2.7 Гистологическое исследование легких, клеточного состава бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) и периферической крови у мышей при моделировании ЭБА
2.7.1 Исследование клеточного состава периферической крови
2.7.2 Методика забора и оценки клеточного состава БАЛ у мышей
2.7.3 Гистологическое исследование легких

2.8 Методика оценки дыхательной функции мышей на введение
неспецифического и специфического раздражителей
2.8.1 Установка для регистрации пневмограмм у мышей
2.8.2 Регистрация пневмограмм
2.8.3 Анализ пневмограмм
2.9 Методы статистической обработки
Глава 3 Результаты собственных исследований
3.1 Оценка различных схем иммунизаций ОА при моделировании
аллергического воспаления в дыхательных путях мышей
3.2 Сравнение иммунологических и морфологических показателей при моделировании аллергического ответа в дыхательных путях мышей линии
ВАЬВ/с и гибридов (СВА х С57ВЬ/6)Р1
3.3 Характеристика разработанной модели ЭБА у мышей
3.3.1 Динамика образования аллерген-специфических антител
3.3.2 Оценка уровней суммарных аллерген-специфических антител,,
3.3.3 Оценка реакции системной анафилаксии у мышей
3.3.4 Оценка клеточного состава периферической крови
3.3.5 Оценка клеточного состава БАЛ
3.3.6 Гистологическое исследование легких
3.3.7 Оценка неспецифической и специфической реактивности бронхов
3.4 Оценка ЭАСИТ модельным аллергеном овальбумином (ОА), химически модифицированным сукцинилированием (сОА) и сОА в комплексе с иммуномодулятором полиоксидонием (ПО)
3.4.1 Сравнительная оценка уровней аллерген-специфических ^Е- и антител до, в течение и после ЭАСИТ
3.4.2 Сравнительная оценка клеточного состава периферической крови и БАЛ у мышей после ЭАСИТ
3.4.3 Сравнительная оценка морфологической картины легких у мышей после ЭАСИТ

3.4.4 Анализ пневмограмм мышей различных групп после ЭАСИТ
3.4.5 Сравнительная оценка выраженности системной анафилаксии у мышей после ЭАСИТ
Глава 4 Обсуждение полученных результатов
Глава 5 Выводы
Список литературы

После выделения трахеи под ее нижнюю треть подводили лигатуру. В средней трети трахеи делали разрез, через который вводили металлическую кашолю с тупым концом, фиксируя канюлю лигатурой.
С помощью одноразового шприца, присоединенного к канюле, в легкие вводили среду RPMI 1640 с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (t°= 37°), в объеме 0,5 мл. Шприцем отсасывали введенную в легкие жидкость, и переносили в отдельные стерильные пробирки («Eppendorf»), Процедуру проводили дважды. Общий объем полученного лаважа, составлял 1мл БАЛ от каждого животного, собранный в отдельные пробирки, центрифугировали при 150g в течение 10 минут. После центрифугирования осадок ресуспендировали. Общее количество клеток БАЛ подсчитывалось в камере Горяева. Для дифференцировки клеток БАЛ, готовили мазки на предметном стекле. Мазки фиксировали в метаноле, окрашивали азуром и эозином по Романовскому, и подсчитывали процентное соотношение клеток БАЛ.
Оценка клеточного состава БАЛ в препаратах производилась с использованием иммерсионной микроскопии. Клетки определяли, и дифференцировали на мононуклеары (лимфоциты, макрофаги), нейтрофилы и эозинофилы по стандартным морфологическим критериям. Подсчитывали 200 клеток в каждом микропрепарате. Разрешение микроскопа 100 xl.5 х10.
2.7.3 Гистологическое исследование легких
Некропсию мышей осуществляли с помощью эфирного наркоза. Для гистологического анализа легкие фиксировали в 10% формалине. Обезвоживание и проводку образцов, заливку в парафин проводили ручным способом. Микротомирование парафиновых блоков для получения срезов толщиной 5-6 мкм осуществляли с помощью ротационного микротома Reichert Jung. Полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином, азуром и эозином по Романовскому, и по Ван-Гизону, заключали в пихтовый бальзам под покровные стекла для получения постоянных микропрепаратов. Микроскопический анализ