Молекулярная диагностика хромосомных аберраций при лейкозах у детей методом гибридизации с биологическими олигонуклеотидными микрочипами

• Автор: Жаринов, Владислав Сергеевич
• Шифр специальности: 14.00.29
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 105 с. : 12 ил.

Оглавление

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Хромосомные аберрации при лейкозах у детей

1.2. Методы анализа генома

1.3. Минимальная остаточная болезнь

1.4. Применение микрочипов в онкологии

1.5. Изоформы химерных генов

Заключение

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Объект (пациенты) и материал исследования

2.2. Методы исследования

Получение РНК
Последовательности генов
Получение комплементарной ДНК
Полимеразная цепная реакция
Синтез праймеров и олигонуклеотидов
Секвенирование
Подготовка пробы для гибридизации
Г ибридизация
Анализ флуоресцентных сигналов
Математико-статистические методы
Глава 3. Результаты исследований
3.1. Сравнение со стандартной методикой ПЦР
3.1.1 Анализ и характеристики
Чувствительность
Специфичность
Экономическая целесообразность
3.1.2 Секвенирование
3.2. Анализ образцов
3.2.1 Параллельный анализ
3.2.2 Частоты при скрининговом анализе
Глава 4. Результаты исследований
4.1. Определение мест слияния химерных генов
4.1.1. Химерный ген ВСК/АВЬ
4.1.2. Химерный ген РМ1ЖА11А
4.2. Мониторинг минимальной остаточной болезни
Глава 5. Обсуждение результатов исследования
Практические рекомендации
Список литературы
Сокращения и условные обозначения
Приложение

Введение
Проблема молекулярной диагностики лейкозов у детей может быть решена с помощью высокотехнологичного метода, использующего высокие производительность и чувствительность полимеразной цепной реакции (ПНР), точность и специфичность, обеспечиваемые гибридизацией с олигонуклеотидными микрочипами. Последние представляют собой объёмные гелевые ячейки на предметном стекле, которые являются «миниатюрными микропробирками», содержащими уникальные участки ДНК, комплементарные анализируемым фрагментам. Только такой подход позволяет использовать микрообъёмы пробы, обеспечивает необходимую экономичность. Кроме того, комбинация мультиплексной ПЦР и гибридизации дали возможность осуществить анализ значительного числа образцов силами небольшого коллектива в краткие сроки. Определение точных мест перестроек при образовании химерных генов стало возможным благодаря применению технологии гибридизации, выполняющей в данном случае и функцию методов секвенирования. Внедрение молекулярных методов диагностики в детскую онкогематологическую практику в нашей стране активно происходит в последние годы. Такие методы анализа возможно позволят улучшить выживаемость и качество жизни гематологических пациентов детского возраста.
Актуальность проблемы. Лейкозы - злокачественные заболевания кроветворной ткани. Ежегодно, в России регистрируется 1200 новых случаев лейкозов у детей. Еще несколько десятилетий назад, эта группа онкологических заболеваний считалась однородной, а успехи в лечении были не высокими. Однако, благодаря совершенствованию методов выявления лейкозов, росту возможностей лабораторной диагностики, проведению мультицентровых контролируемых исследований ситуация кардинально изменилась в лучшую сторону (Карачунский А.И., 1999, Самочатова Е.В., 1999). На основании данных морфологии, цитохимии,

иммунофенотипирования удалось выявить варианты лейкозов и разделить ранее однородную патологию на конкретные нозологические формы и группы риска, требующие дифференцированной терапии. Это увеличило число пациентов, вышедших в стойкую ремиссию или излечившихся. Основным событием в исследовании лейкемии у человека последнего времени являются открытия конкретных генетических перестроек, либо приводящих непосредственно к появлению опухолевого клона, либо имеющих огромное прогностическое значение.
История прихода генетики в диагностику и лечение лейкозов ведёт начало с описания в 1960 году Nowell и Hungerford укороченной 22-ой хромосомы у больного с хроническим миелолейкозом. Такая картина повторялась от больного к больному, то есть она была «неслучайной» (Nowell, Hungerford, 1960). Эта хромосома была названа Филадельфийской и затем было показано, что она образуется в результате транслокации (de Klein А, 1982). Значение этого эпизода было колоссально, поскольку диагностика лейкозов была выведена на молекулярный уровень. В последние годы этот путь привел к созданию препаратов, которые выборочно блокируют действие онкобелков. Одним из первых был препарат Гливек, который открыл новую страницу в терапии хронического миелолейкоза. С тех пор было идентифицировано множество неслучайных хромосомных поломок напрямую участвующих в формировании онкологического заболевания, либо влияющих на его течение и прогноз, а в части случаев лишь помогающих следить за прогрессией заболевания или за остаточным пулом клеток опухоли (Rowley JD, Aster JC, 1993). Однако, ещё большее число обнаруженных транслокаций до сих пор носит характер случайных и требует дальнейшего изучения их роли в формировании или развитии опухоли.
Современные молекулярно-биологические методы позволяют разделить всех пациентов с различными формами лейкозов на крупные подгруппы по наличию неслучайных транслокаций, или же их

определять уровень минимальной остаточной болезни. Более того, чувствительности российского метода вполне достаточно, поскольку выяснено, что прогностически важен уровень более 10"4, как это было описано ранее. Более низкие концентрации могут сохраняться длительно (35 месяцев) после окончания лечения, без дальнейшего рецидива или обнаруживаться у совершенно здоровых людей [119, 19]. Видимо, в этом случае, при более низком уровне таких клеток с реарранжировками, они благополучно элиминируются иммунной системой. Ещё одним вариантом, развивающим идею мультиплексной ПЦР и последующей идентификации продуктов, является система «жидкостных микрочипов», что вполне согласуется с общим принципом минимизации и разобщения, заложенном в микрочиповую технологию. Авторы в качестве отдельных ячеек -реакционных объёмов - использовали бусинки (микрошарики) выпускаемые фирмой Luminex Со. (США) и набор для прикрепления олигонуклеотидных проб к ним. Были выбраны наиболее интересные с клинической точки зрения транслокации для анализа в модельных экспериментах. Это были t(9;22) и её основные изоформы, t(4;ll), t(l;19), t(12;21). Использовались контрольные культуры и 60 клинических образцов от детей и подростков. Метод достаточно дешев, удобен и быстр в применении. Было показано полное совпадение с клинической картиной и данными, полученными от стандартной ПЦР и цитогенетики. Удалось избежать за счёт гибридизационного подхода четырёх ложноположительных результатов по данным мультиплексной ПЦР, что могло быть следствием деградации РНК на этапе подготовки пробы, как предположили авторы. Метод достаточно чувствительный и специфичный [140]. Подобный метод с использованием ОТ-ПЦР, микрошариков и проточного цитометра применили для анализа хромосомных аберраций при гемобластозах и другие исследователи. Фирма производитель микросфер была Spherotech Inc. (США). Авторы анализировали клеточные линии и образцы от пациентов на наличие ряда химерных генов а