Молекулярно-биологические факторы прогноза у пациентов с острыми лейкозами при аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток

• Автор: Сипол, Александра Андреевна
• Шифр специальности: 14.00.29
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 144 с. : 9 ил.

Список сокращений

Глава 1. Обзор литературных данных

1.2. Молекулярно-генетические маркеры острого лимфобластного лейкоза

1.2. Молекулярно-генетические маркеры острого миелобластного лейкоза

1.3. Принципы терапии острых лейкозов

1.4. Аллогенная трансплантация гемопоэтических стволовых

клеток

1.5. Показания к аллоТГСК при острых лейкозах

1.6. Рецидивы острых лейкозов

1.7. Факторы, определяющие прогноз при аллоТГСК

1.8. Полиморфизм иммунорегуляторных цитокинов

1.9. Полиморфизм гена множественной лекарственной резистентности
1.10. Методы диагностики минимальной остаточной болезни
1.11. Гемопоэтический посттрансплантационный
«химеризм» (ПТХ)
1.12. Дополнительные маркеры «минимальной остаточной болезни»
1.13. Биологические образцы, используемые для определения «минимальной остаточной болезни» (периферическая кровь
или костный мозг)
1.14. Клиническая значимость определения МОБ
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Общая характеристика исследуемых групп
2.2. Получение материала и его характеристика
2.2.1. Выделение лейкоцитов
2.2.2. Выделение геномной ДНК
2.2.3. Выделение тотальной РНК
2.2.4. Приготовление кДНК
2.3. Изучение аллельного полиморфизма генов Ил-6, Ил-10,

2.3.1. Проведение полимеразной цепной реакции
2.4. Метод исследования ПТХ на основе панели полиаллельных генетических систем
2.5. Диагностика хромосомных аберраций
2.5.1. Количественная ПЦР в режиме реального времени
2.5.2. Получение разведений клеточных линий
2.5.3. Протокол выделения лимфоцитов на градиенте плотности фикола
2.5.4. Количественная интерпретация результатов амплификации
2.6. Статистическая обработка результатов исследования
Глава 3. Анализ прогностического значения аллельного
полиморфизма генов Ил-6, Ил-10, МЛР
3.1. Распределение аллельного полиморфизма генов Ил-6,
Ил-10, МЛР-1 в объединенной группе доноров ГСК и реципиентов
3.2. Прогностическое значение аллельного полиморфизма
гена Ил
3.3. Прогностическое значение полиморфизма гена Ил
3.4. Прогностическое значение полиморфизма гена МЛР
3.5. Анализ общей выживаемости пациентов после аллоТГСК в зависимости от совпадения полиморфизмов генов Ил-6, Ил-10, МЛР-1 у
доноров ГСК и реципинтов
Глава 4. Динамика ПТХ после аллоТГСК. Прогностическое значение
оценки ПТХ
4.1. Днамика ПТХ в зависимости от интенсивности
режима кондиционирования

4.2. Анализ общей выживаемости пациентов после
аллоТГСК в зависимости от показателей ПТХ на различных сроках
4.3. Прогностическое значение ПТХ в зависимости от интенсивности режима кондиционирования
4.4. Анализ частоты рецидивов у пациентов после аллоТГСК
в зависимости от ПТХ
4.5. ПТХ в зависимости от стадии заболевания на момент аллоТГСК
4.6. Анализ количественных значений ПТХ
Глава 5. Детекция генетических аберраций. Количественная ПЦР в режиме реального времени для диагностики “минимальной остаточной
болезни” у пациентов после аллогенной ТГСК
Глава 6. Многофакторное моделирование для оценки степени влияния
изучаемых предикторов на вероятность рецидива после аллоТГСК
Глава 7. Обсуждение результатов
Выводы
Практические рекомендации
Список литературы
Таблица 2.3.
Праймеры для определения SNP-полиморфизма.
Г ен (положение полиморфизма) Последовательность праймера
МЛР-1 (С3435Т) FP(C) FP(T) RP 5 ’ gtg gtg tea cag gaa gag gtc 3 ’ 5’ gtg gtg tea cag gaa gag gtt 3’ 5’ act ata ggc cag aga ggc tgc 3’
Ил - 6 (C-174G) FP(C) FP(G) RP 5 ’ ccc tag ttg tgt ett gcc 3 ’ 5 ’ ccc tag ttg tgt ett geg 3 ’ 5’ gag ett ctc ttt egt tcc 3’
Ил - 10 (A-1082G) FP(A) FP(G) RP 5’-cta cta agg ett ett tgg gaa-3’ 5’-tac taa ggc ttc ttt ggg ag-3’ 5’-cag ccc ttc cat ttt act ttc-3’
Учитывая биаллельный полиморфизм промотеров исследуемых генов, реакции для каждого аллельного варианта гена проводили в разных пробирках с использованием различных наборов праймеров. Реакционная смесь в конечном объеме 10 мкл содержала: 2 мкл ДНК, 14 пмолей каждого праймера, смесь дНТФ в конечной концентрации 240 мкМ и 2,5 единиц термостабильной Taq ДНК-полимеразы в стандартном буфере с содержанием Mg2+ - 15 мМ. Амплификацию проводили на термоциклере GeneAmp PCR System 9700. Программа амплификации для аллельных вариантов промоторных областей гена МЛР-1 состояла из 40 циклов, включавших денатурацию (94°С - 20 сек), отжиг праймеров (61°С - 30 сек) и элонгацию (72°С - 40 сек), с начальной денатурацией (9б°С - 3 мин) и финальной достройкой (72°С - 1 мин). Программы амплификации для генов ИЛ-6, ИЛ-10 отличались по температуре отжига праймеров: 55°С - 50 сек. Визуализацию продукта амплификации проводили с помощью электрофореза в 2% агарозном геле с окраской этидием бромидом. Результаты оценивали по