Особенности синтеза стресс белков и антиоксидантной системы в лимфоцитах крови больных ревматоидным артритом

• Автор: Фунт, Вячеслав Алексеевич
• Шифр специальности: 14.00.16
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Пущино
• Количество страниц: 109 с. : ил.

1. РЕВМАТОИДНЫЙ АРТРИТ

1. 1 Этиология и патогенез ревматоидного артрита

1.2 Гуморальный иммунитет при РА

1.3. Клеточный иммунитет при РА

1.5. Современные методы терапии РА

2. БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА

2.1. КлассхкЬикаиия. биологическая роль

2.2. БТШиРА

2.3. БТШиЭМП

3. РЕАКТИВНЫЕ ФОРМЫ КИСЛОРОПА И АНТИОКСИПАНТНАЯ СИСТЕМА ПРИ РА

4. БИОРЕЗОИАНСНАЯ ТЕРАПИЯ

4.1. Энепго-информаююнные подходы в применении электромагнитных излучений в лечебных целях
4.2. Биопезонансная терапия. Принципы. методы, аппаратура
4.3. Эффективность использования БРТ161
5. АКУПУНКТУРНАЯ ТЕРАПИЯ
6. РЕЗЮМЕ
Глава II
МЕТОПЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Характеристика пациентов
2. Методики исследования синтеза белков лгшгЬоиитами крови пациентов
4. Методики измерения Ферментативной активности антиоксидантной системы лимФоиитов
5. Статистический анализ
6. Методики пповедения БРТ и акупунктуры
Глава III
РЕЗУЛЬТА ТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Синтез конститутивных и индуиибельных (БТШ) белков в лимфоцитах кпови человека в состоянии здоровья, при РА а других патологиях
1.2. Синтез конститутивных белков и индуиибельных тепловым шоком стресс белков в лимфоиитах здоровых людей
1.3. Синтез конститутивных белков и индуиибельных тепловым шоком стресс белков в лимфоцитах кпови больных РА
1.4. Синтез конститутивных белков и индуиибельных тепловым шоком стресс белков лимфоцитами человека при других заболеваниях
1.5. Обсуждение полученных результатов
2. Изменение синтеза конститутивных и индуиибельных тепловым шоком (стресс белков или БТШ) белков в лшкЬоиитах кпови человека ппи РА и других патологиях в результате проведения БРТ и акупунктурной терапии
2.1. Изменения в синтезе белков лимфоцитами кпови больных РА в результате проведения БРТ
2.2. Изменения в клинических проявлениях РА у больных в результате пповедения БРТ
2.3. Изменения синтеза белков лшкЬоиитами человека в результате пповедения БРТ при других заболеваниях
2.4. Изменения синтеза белков лимфоцитами человека в результате акупунктурных воздействий ппи РА и других патологиях
2.5. Обсуждение полученных результатов
3. Изменение активности антиоксидантной системы лимфоцитов при РА в результате пповедения БРТ
3.1. Результаты исследований А ОС лимфоцитов при РА в ппоиессе БРТ
3.2. Обсуждение полученных результатов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:
АНФ - антинуклеарные факторы АТФ - аденозинтрифосфорная кислота 1 АОС - антиоксидантная система
*! АКТГ - адренокортикотропный гормон
АТ - акупунктурная терапия БАТ - биологически активные точки ф БАЗ - биологически активные зоны
БРТ - биорезонансная терапия БТШ - белки тепловго шока БФС - бромфеноловый синий ВГ- восстановленный глутатион ГП - глутатионпероксидаза ГПТБ - гидроперекись трет-бутила ГРБ - глюкозрегупируемые белки ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДСН - додецилсульфат натрия ДТТ -1,4- дитиотреитол
ДТНБ - 5,5'-дитио-бис(-2-нитробензойная) кислота ИК - иммунные комплексы ЛТ - лазерная терапия _ НГТ - нитроголубой тетразолий
ПААГ - полиакриламидный гель
ПЭМП - пульсирующее электромагнитное поле ПМ - периферические мононуклеары ч РА - ревматоидный артрит
РФК - реактивные формы кислорода РФ - ревматоидные факторы РНК - рибонуклеиновая кислота СБА - спонтанная биоэлектрическая активность СОД - супероксиддисмутаза СКВ - системная красная волчанка ФБД - фосфатный буфер Дюльбекко ЦНС - центральная нервная система ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы ЭДТА - этилендиаминтетраацетат ЭП УВЧ - электрическое поле ультравысокой частоты ЭМП СВЧ - электромагнитные поля сверхвысоких частот ЭМИ - электромагнитные излучения ЭЭГ - электроэнцефалограмма ® ЭКГ - электрокардиограмма
CD4+, CD8+, CD4-, CD8- CD28 - маркировка субпопуляций Т-лимфоцитов соответственно их рецепторным молекулам
IgA, IgG, IgM, IgD - иммуноглобулины соответствующих классов IFN-y - интерферон гамма
IL-1, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 - соответствующие интерлейкины-1 и т.д.
GM-CSF - гранулоцит-макрофагколониестимулирующий фактор k МНС, HLA, HLA-DR и др. - молекулы главного комплекса гистосовместимости и их локусы
TGFp- бета-фактор роста клеток TNFa- фактор некроза опухоли альфа

Актуальность проблемы. Ревматоидный артрит (РА) является хроническим прогрессирующим системным заболеванием неизвестной этиологии, связанным с аутоиммунными нарушениями. Несмотря на успехи современной медицины, проблема лечения РА во многом остается пока нерешенной. По литературным данным этим недугом страдают от 1 до 2 % населения мира [56, 219], что ярко демонстрирует актуальность исследований этиопатогене-за РА и поиска эффективных методов его терапии.
Для РА характерна аутоиммунная агрессия против собственных тканей (суставов), которая, как ни странно, сочетается с гипореактивностыо Т-клеток [201]. И белки теплового шока или стресс белки (БТШ), как считают, могут выполнять ключевую роль в нарушении иммунной толерантности и функциональной недостаточности лимфоцитов одновременно [228]. С одной стороны, при экспериментальном моделировании артритов на животных показано, что введение грызунам БТШ 65 кД из Mycobacterium tuberculosis в сочетании с полным адьювантом Фрейнда инициирует артрит, напоминающий РА человека [225]. С другой стороны, на этих же моделях доказано, что предварительная стимуляция иммунитета к собственному БТШ 60, используя бактериальный БТШ 60 или его консервативные пептиды, повышает резистентность к последующей индукции артрита [223].
Исследования аутореактивности к собственным БТШ у больных РА действительно обнаружили наличие аутореактивных Т-клонов, пролиферирующих в ответ на стимуляцию БТШ 60 кД, а также антител против собственных стресс белков. Однако они не являются уникальными для данного заболевания и обнаруживаются при большинстве других воспалительных заболеваний (инсулинзависимый диабет, болезнь Крона, ювенильный РА, реактивный артрит, болезнь Бехчета, красная волчанка, множественный склероз). Кроме того, анти-БТШ Т-клоны нередко встречаются у здоровых лиц, особенно, пожилого возраста [227].
В настоящее время иммунные реакции против БТШ рассматриваются скорее как регуляторные или защитные, чем патогенные [113, 122, 224]. Исследования иммуногенности отдельных пептидов БТШ 60, 70 кД показали, что БТШ несут консервативные участки, которые при предоставлении иммунным клеткам в совокупности с молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС) исполняют роль костимулирующих сигналов для тех или иных Т-клеточных популяций [122, 173, 188]. Предполагают, что нарушение данного механизма может приводить к поломке иммунного узнавания “свой-чужой”, а также являться причиной гипореактивности Т-клеток.
Определение молекулярной массы и изоэлектрической точки (ЪГ) полипептидов белков.
Молекулярную массу полипептидов белков определяли согласно калибровочной кривой как десятичный логарифм от пройденного пути в электрическом поле. Для построения калибровочной кривой использовались стандартные наборы белков-маркеров для ДСН-электрофореза фирмы "Sigma".
Изоэлектрические точки белков определяли по pi известных белков [109]. Авторадиография.
Авторадиографию проводили экспонированием окрашенных кумасси R250 и высушенных гелей с рентгеновской пленкой РТ-1В ("Свема") в течение 15 суток. Рентгеновские пленки проявляли в соответствии с их инструкциями, высушивали и сканировали на автоматическом двулучевом денситометре (ИБФ, Пущино) (для гелей после ДСН-ПААГ электрофореза). Денситограммы анализировались с помощью интегратора Chromatopac C-R3A ("Shimadzu").
4. Методики измерения ферментативной активности антиоксидантной системы лимфоцитов.
Опенка системы глутатиона.
Систему глутатиона (ВГ) оценивали по содержанию восстановленных тиоловых
групп небелкового происхождения и активности глутатионпероксидазы (ГП).
Концентрацию восстановленных тиоловых групп определяли с использованием 5,5'-дитио-бис(-2-нитробензойной) кислоты (ДТНБ) по методике Гавриловой А.Н. и др. (1986) в модификации Карпищенко А.И. с соавт. [39]. Метод основан на образовании при взаимодействии ДТНБ с кислоторастворимыми SH-группами окрашенного продукта, имеющего максимум поглощения при длине волны 412 нм. С этой целью 3x106 клеток, отмытых в ФБД (см. выше) и осажденных центрифугированием ресуспендировали в 0,3 мл буфера 0,1 М Трис-НС1 pH 8,5, содержащего 0,01% ЭДТА, и разрушали трехкратным замораживанием-оттаиванием при -20°С. К лизату клеток добавляли 0,06 мл 20% трихлоруксусной кислоты для осаждения белков и суспензию центрифугировали 10 мин. при 8000 об/мин. Супернатант в количестве 0,34 мл отбирали, добавляли 0,045 мл 4 М NaOH для восстановления кислотности среды (pH 8,5) и 1,525 мл буфера 0,1 М Трис-НС1 pH 8,5 + 0,01 % ЭДТА. Реакцию проявления тиоловых групп инициировали добавлением 0,09 мл ДТНБ, предварительно растворенного в этаноле из расчета 1 мг ДТНБ на 1 мл этанола. После развития окраски пробы фотометрировали при длине волны 412 нм в кварцевой кювете объемом 2 мл и длиной пути луча 1 см на спектрофотометре "KONTRON" против дистиллированной воды. Расчет концентрации тиоловых групп осуществляли по калибровочному графику, построенному