Совершенствование средств мониторинга блютанга на основе полимеразной цепной реакции

• Автор: Гаврилова, Екатерина Анатольевна
• Шифр специальности: 06.02.02
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Покров
• Количество страниц: 151 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 .Характеристика вируса блютанга
1.1.1. Устойчивость к физико-химическим воздействиям
1.1.2. Структурная организация генома и полипептидный
состав вируса
1.2. Антигенные свойства вируса блютанга
1.3. Патогенез, тропизм, цикл репродукции вируса
1.4. Клиническая картина блютанга
1.4.1. Клинические признаки у КРС
1.4.2. Клинические признаки у овец
1.5. Эпизоотическая ситуация по блютангу в мире
1.6. Эпизоотическая ситуация по блютангу в Европе
1.7. Диагностика блютанга
1.7.1. Применение ПЦР в идентификации вируса блютанга
1.8. Заключение по обзору литературы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.1.1. Вирусы
2.1.2. Пробы крови и патматериала от естественно инфицированных и экспериментально зараженных овец и КРС
2.1.3. Культуры клеток
2.1.4. Животные
2.1.5. Плазмида и бактериальные штаммы
2.1.6. Реактивы
2.1.7. Лабораторное оборудование
2.2. Методы

2.2.1. Выделение и очистка нуклеиновых кислот
2.2.2. Постановка ОТ-ПЦР
2.2.3. Анализ ПЦР продуктов
2.2.4. ПЦР в формате реального времени
2.2.5 .Нуклеотидное секвенирование
2.2.6.Программное обеспечение
2.2.7. Постановка ИФА
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Разработка тест-систем для идентификации вируса блютанга с помощью полимеразной цепной реакции
3.2. Отработка методов выделения вирусной РНК
3.3. Сравнительные исследования чувствительности и специфичности вариантов ОТ-ПЦР с использованием праймеров, гомологичных различным сегментам генома вируса блютанга
3.3.1. Изучение чувствительности и специфичности «полугнездовой» ОТ-ПЦР
3.4. Разработка ОТ-ПЦР в режиме реального времени
3.4.1.Подбор праймеров и гибридизационного зонда
3.4.2.Оптимизация условий постановки ОТ-ПЦР в режиме реального времени
3.4.3. Оптимизация условий калибровки прибора «Rotor Gene» 6000
3.4.4. Определение чувствительности и специфичности ОТ-ПЦР в режиме реального времени
3.5. Модификация ОТ-ПЦР в режиме реального времени с предварительной амплификацией специфического участка кДНК
3.6. Количественная оценка содержания копий специфической последовательности кДНК в пробе
3.7. Определение персистенции РНК вируса блютанга в пробах крови от экспериментально зараженных животных

3.7.1. Результаты исследований проб крови от телят, инфицированных вирусом блютанга (1, 4 и 8 серотипы) в ОТ-ПЦР в режиме реального времени
3.8. Мониторинговые исследования проб крови импортированного крупного рогатого скота на блютанг, проведенные в ГНУ ВНИИВВиМ за
2008 и 2009гг
3.9. Филогенетический анализ выделенного полевого изолята ВБ
4. ОБСУЖДЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
8. Приложения

серотипа 1 вируса блютанга обладал дополнительными сегментами. С целью разработки группоспецифического ОТ-ПЦР в качестве мишени использовали сегмент генома, кодирующий N81 белок. Использованные праймеры успешно амплифицировали продукт величиной 274 п.о. При исследовании различных серотипов вируса было установлено, что амплификация являлась группоспецифической. Для специфического обнаружения всех изолятов вируса блютанга полученный ПЦР-продукт метили дигоксегинином (ДИГ) и использовали его в реакции гибридизации методом дот-блоттинга. Таким образом была предложена возможность использования нерадиоактивно меченого зонда для обнаружения различных серотипов вируса блютанга.
Тойшоп е1 а1. (2000) разработали мультиплексный вариант ПЦР для одновременного определения 5-ти серотипов американских изолятов вируса блютанга. Для этого было использовано 5 пар праймеров, комплементарных 2-му сегменту генома и каждая пара была специфична для одного серотипа. При исследовании этим методом всех известных серотипов блютанга и 9-ти серотипов ЭГБО были точно определены пять североамериканских серотипов блютанга. Сравнение результатов ОТ-ПЦР и PH показало, что ОТ-ПЦР является более экспрессным и специфичным анализом. PH представляет собой более трудоемкий и длительный процесс.
ЕаЩп В.Т. а1. (2004) также в качестве новой диагностической платформы к традиционной ПЦР разработали мультиплексный вариант, который позволяет проводить несколько реакций совместно в одной пробирке.
Для идентификации разных серотипов вируса блютанга используют праймеры, комплементарные 2-ому и 5-ому вариабельным сегментам, а также 3, 6 и 7 сегментам для идентификации разных топотипов в пределах одного серотипа.
Маап Б.е! а1. (2004) разработали одностадийную ОТ-ПЦР на 2 сегмент
генома, позволяющую идентифицировать 5 серотипов полевого вируса
блютанга (1, 2, 4, 9 и 16), при этом были подобраны по паре праймеров,
специфичных для каждого серотипа. Размер ПЦР-продукта при амплификации