Разработка технологии дрожжевой липазы для применения в пищевой промышленности

• Автор: Гаскарова, Елена Фидаевна
• Шифр специальности: 05.18.07
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 215 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Введение

Глава 1 Обзор литературы

1.1 Липаза и ее изоформы

1.2 Механизм действия фермента

1.3 Источники получения липаз

1.4 Характеристика дрожжевых липаз

1.4.1 Синтез липаз дрожжами Candida rugosa

1.4.2 Липазы дрожжей Candida antarctica

1.4.3 Липазы дрожжей Candida lypulytica и Candida cylindracea
1.4.4 Липазы дрожжей Geotrichum candidum
1.4.5 Липазы дрожжей рода Trichosporon
1.4.6 Иные дрожжевые продуценты липазы
1.5 Условия увеличения биосинтеза липазы дрожжами
1.5.1 Разработка питательных сред для продуцентов липаз
1.5.2 Иммобилизация липаз
1.5.3 Биокаталитическая инженерия
1.5.4 Белковая инженерия
1.6 Применение ферментных препаратов липазы
1.7 Функциональные свойства некоторых жирных кислот, получаемых при липолизе растительных масел
Заключение
Глава 2 Материалы и методы

2.1 Приборы, расходные материалы и лабораторная посуда, используемые в работе
2.2 Химические реактивы
2.3 Питательные среды, используемые в работе
2.4 Биологические объекты, использованные в работе
2.5 Источники выделения микроорганизмов, обладающих липазной активностью
2.6 Использованные методы
2.6.1 Скрининг микроорганизмов - продуцентов липаз, выделенных из природных мест обитания
2.6.2 Исследование культуральных и физиолого-биохимических свойств продуцентов липолитических ферментов
2.6.3 Изучение морфологии клеток
2.6.4 Исследование культуральных признаков
2.6.5 Физиолого-биохимические свойства микроорганизмов
2.6.6 Изучение филогенетических особенностей дрожжевой культуры
2.6.7 Определение величины pH растворов
2.6.8 Определение содержания сухих веществ
2.6.9 Определение массовой доли золы
2.6.10 Определение массовой доли жира
2.6.11 Определение массовой доли белка по методу Лоури
2.6.12 Определение количества клеток микроорганизмов высевом на плотные питательные среды (метод Коха)
2.6.13 Определение количества мезофильных аэробных и факультативноанаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ), дрожжей и плесневых грибов

2.6.14 Выращивание культур микроорганизмов
2.6.14.1 Выращивание культуры дрожжей поверхностным способом на плотных питательных средах
2.6.14.2 Выращивание культуры дрожжей в условиях глубинной ферментации
2.6.15 Проведение УФ-индуцированного мутагенеза
2.6.16 Методы определения ферментативных активностей
2.6.16.1 Методы определения липазной активности ферментов
2.6.16.1.1 Качественное определение наличия липазной активности у штаммов-продуцентов, выращенных на тест-среде
2.6.16.1.2 Титриметрический метод определения липазной активности с применением субстрата оливкового масла (модифицированный метод Ота, Ямада)
2.6.16.1.3 Метод дезинтеграции клеток для определения внутриклеточной активности липазы
2.6.16.2 Метод определения протеолитической активности ферментов
2.6.16.3 Метод определения амилолитической активности ферментов
2.6.16.4 Метод определения каталазной активности ферментов
2.6.17 Осаждение ферментов из культуральной жидкости органическими растворителями
2.6.18 Метод стабилизации и активации ферментного препарата неорганическими соединениями
2.6.19 Определение молекулярной массы белковых фракций ферментного препарата липазы М10-10 Г20х методом гель-фильтрации
2.6.20 Методы определения физико-химических параметров действия липазы

алкилсилана [Reetz и др., 1996], однако также может использоваться хитозан [Pereira и др., 2002].
1.5.3 Биокаталитическая инженерия
Вторым из наиболее часто применяемых способов повышения выхода липазы являются манипуляции со штаммом-продуцентом на генетическом уровне. Большая часть исследований была посвящена попыткам получения мутантов с более высоким выходом липазы, чем у исходных штаммов, при этом использование таких гетерологичных экспрессионных систем, как Pichia pastoris, также может считаться биокаталитической инженерией. Эффективным способом увеличения продукции липазы может быть увеличение копийности гена, поскольку увеличение числа копий гена приведет к повышению выхода липазы [Fickers и др., 2005].
1.5.4 Белковая инженерия
Активность липазы возможно также изменить третьим способом - за счет структурных модификаций фермента. Schmitt и соавторы создали синтетические гены lip 1 штамма C. rugosa, экспрессирующиеся в P. pastoris, и провели анализ субстратной специфичности к длине цепи. Авторы вносили точечные мутации, заменяя отдельные аминокислоты в белке, и получали мутанты с различной специфичностью к длине цепи [Schmitt и др., 2002]. Magnusson и др. изменяли размер центра связывания активного центра, отвечающего за стереоспецифичность липазы В C. antarctica, путем замены аминокислот таким образом, чтобы вторичные спирты могли взаимодействовать с липазой, что привело к расширению списка пригодных для фермента субстратов. Данный подход является очень перспективным и требуется активизация исследований в этой области, чтобы получать липазы с различной специфичностью действия [Magnusson и др., 2005].