Разработка ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота

• Автор: Драгунова, Екатерина Евгеньевна
• Шифр специальности: 05.18.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Кемерово
• Количество страниц: 170 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР

1.1. Строение прионных белков, их функции в организме

1.2. Прионные болезни. Классификация, механизмы возникновения и развития прионных энцефалопатий у человека и животных
1.3. Методы выявления возбудителей и диагностика прионных болезней. Контроль качества сырья животного происхождения

1.4. Заключение по обзору литературы и задачи исследований

ГЛАВА 2. ОРГАНИЗАЦИЯ, ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Организация выполнения работы

2.2. Объекты исследований

2.3 Методы исследований
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ^
ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Определение образцов животного происхождения с наиболее высокой степенью потенциальной опасности в отношении продукции пато-
генных форм прионного белка
3.2 Исследование и анализ нуклеотидных последовательностей гена ^ Р1ЮТ прионного белка
3.3. Конструирование олигонуклеотидных праймеров для дифференциальной амплификации специфических последовательностей прионного 76 белка
3.4. Выбор параметров и оптимизация процессов амплификации фраг-

ментов гена РКИР патогенного прионного белка
3.5. Разработка положительного контрольного и внутреннего контроль- ^ ного образцов для оценки эффективности протекания ПЦР

3.6. Исследование специфичности разработанной тест-системы и олиго-
нуклеотидных праймеров
ГЛАВА 4. ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
4.1. Методика изготовления ПЦР-тест-системы и ее описание
4.2. Оценка условий хранения и установление достоверных сроков пригодности ПЦР-тест-системы
4.3. Расчет затрат на проведение исследования с помощью ПЦР-тест-системы
4.4. Проведение технико-экономической оценки рыночного потенциала
полученных результатов
ВЫВОДЫ
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
ПРИЛОЖЕНИЯ
ПРИЛОЖЕНИЕ А Государственный контракт № 16.512.11.2077 на
выполнение научно-исследовательских работ
ПРИЛОЖЕНИЕ Б Технические условия на ПЦР - тест систему для
идентификации патогенного прионного белка
ПРИЛОЖЕНИЕ В Методические указания по использованию
ПЦР - тест системы
ПРИЛОЖЕНИЕ Г Акт результатов испытаний №1 чувствительности ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка
крупного рогатого скота
ПРИЛОЖЕНИЕ Д Акт результатов испытаний №2 достоверных сроков пригодности ПЦР-тест-системы для идентификации патогенного прионного белка крупного рогатого скота

ВВЕДЕНИЕ
Прионы (от англ. «proteinaceous infectious particles» - белковая инфекционная частица) - особый класс чисто белковых инфекционных агентов, не содержащих нуклеиновых кислот, вызывающих тяжёлые заболевания центральной нервной системы у человека и ряда высших животных.
Прионный белок может существовать в двух формах - неинфекционного белка, который является жизненно необходимым белком, обнаруживаемым в организме всех млекопитающих, включая и человека, и инфекционного белка, который является мутацией нормального прионного белка и вызывает прионные болезни животных и человека.
Прионные болезни - это группа трансмиссивных нейродегенеративных заболеваний животных и людей. Эти болезни имеют длительные инкубационные периоды, но быстро прогрессируют с момента клинического начала заболевания. Все прионные болезни смертельны и в настоящее время не существует эффективных способов их лечения.
Изучение прионов и вызываемых ими заболеваний является новой, быстро развивающейся областью биомедицинских исследований, которая в последние годы приобрела важное научно-практическое значение.
Практический интерес связан, прежде всего, с разразившейся эпизоотией губчатой энцефалопатии коров в Великобритании, а также с выявлением, в основном в Великобритании, молодых людей с болезнью Крейтцфельд-та-Якоба и доказательством возможности передачи этого заболевания людям в результате употребления в пищу мясопродуктов, полученных от зараженных животных.
Также одним из путей заражения человека губчатой энцефалопатией являются нейрохирургические вмешательства, трансплантация тканей, назначение гормонов, полученных от зараженных доноров с нераспознанной болезнью Крейтцфельдта-Якоба (ятрогенные случаи болезни Крейтцфельдта-Якоба), использование для полива овощей и фруктов сточных вод, в которые

оператора, длительное время проведения исследования, недостаточная чувствительность (неоднозначность интерпретации отрицательных результатов исследования).
Кроме методов диагностики, основанных на реакции антиген - антитело, предложены другие оригинальные подходы. Разрабатывается и проходит апробацию метод, по своему принципу напоминающий полимеразную цепную реакцию. Он основан на инициации конверсии РгРс в PrPSc в смеси нормального и потенциально зараженного мозга с помощью циклической обработки материала ультразвуком [140].
В настоящее время основные усилия исследователей TSE по-прежнему направлены на разработку прижизненного метода диагностики прионных инфекций. Исследование, продемонстрировавшее заражение здоровой овцы патогенной формой приона при переливании крови от инфицированных губчатой энцефалопатией особей крупного рогатого скота и скрепи доноров, показало, что создание теста TSE по обнаружению возбудителя в биологических жидкостях животных, а, следовательно и человека, возможно [52, 85].
Впервые прижизненный (преклинический) тест для выявления патогенного прионного белка скрепи в периферической лимфоидной ткани был разработан на основе ИГХ [65]. Этот уникальный тест выявляет PrPSc в лимфоидном органе инфицированной овцы за месяцы или годы до появления первых клинических признаков болезни [60, 119]. Данный метод позволяет осуществлять мониторинг скрепи среди поголовья живых овец и отбирать клинически здоровых взрослых особей для племенных целей.
Разработка других сверхчувствительных преклинических методов анализа и концентрации прионных молекул в образцах остается приоритетной задачей диагностики TSE. Так, используя метод конфокальной двухцветной флуоресцентной спектроскопии, удалось обнаружить инфекционную форму приона в цереброспинальной жидкости, т. е. сделать шаг к прижизненной диагностике TSE [9]. В данной диагностической системе была достигнута чув-