Влияние полиморфизма гена каталазы на индуцированный окислительным стрессом апоптоз лейкоцитов и клеток меланомы кожи

• Автор: Комина, Анна Владимировна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Красноярск
• Количество страниц: 100 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Физиологические функции про- и антиоксидантых систем, роль окислительного стресса в развитии патологии

1.1.1 Дыхательная цепь митохондрий и образование активных форм кислорода

1.1.2 Пероксид водорода и его физиологическая роль

1.1.3 Повышение уровня активных форм кислорода в клетке — окислительный стресс, его роль в норме и патологии
1.1.4 Антиоксидантная система клетки. Каталаза как компонент антиоксидантной защиты

1.2 Дефекты каталазы и жизнеспособность клеток в условиях окислительного стресса

1.3 Апоптоз как вариант реакции на окислительный стресс
1.3.1 Сигнальные пути апоптоза
1.3.2 Роль нарушений апоптоза в процессах опухолевого роста
1.4 Изучение механизмов апоптоза. Роль митохондриального белка-транслокатора ТБРО в реализации апоптоза
1.4.1 Периферический бензодиазепиновый рецептор (ТБРО) как маркер митохондриального пути передачи апоптотического сигнала
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Культивирование клеток
2.2 Индукция окислительного стресса
2.3 Методы морфологического исследования
2.3.1 Оценка уровня апоптоза
2.4 Методы молекулярно-генетического исследования
2.4.1 Выделение ДНК
2.4.2 ПДРФ анализ
2.4.3 Выделение мРНК
2.4.4 ПЦР в реальном времени
2.5 Биохимические методы исследования
2.5.1 Измерение активности антиоксидантных ферментов
2.6 Статистическая обработка результатов
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Формирование групп нормальных клеток с различной активностью катал азы
3.1.1 Распределение полиморфизма С-262Т гена CAT в мононуклеарных лейкоцитах
3.1.2 Определение активности каталазы в эритроцитах людей с различными вариантами полиморфизма С-262Т гена каталазы
3.2 Сравнение распределения полиморфизма С-262Т гена каталазы в здоровых и опухолевых клетках
3.3 Определение активности каталазы в лейкоцитах периферической крови в состоянии окислительного стресса
3.4 Оценка выраженности апоптоза клеток при индукции окислительного стресса
3.5 Определение уровня экспрессии белка-транслокатора (TSPO) в лейкоцитах при индукции окислительного стресса в клетках в зависимости от полиморфизма С-262Т гена каталазы
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
CAT - ген, кодирующий фермент каталазу TSPO - Translocator protein
кДНК - комплементарная ДНК, ДНК, созданная на основе матричной РНК
методом обратной транскрипции
мРНК - матричная рибонуклеиновая кислота
ПДРФ-анализ - анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов

мужчин - 62,03±14,50 лет (24 - 81 год). Основным местом локализации плоскоклеточного рака была голова (включая расположение на нижней губе, ушной раковине, нижней челюсти) - 76,0 %.
Нельзя не отметить, что в группах условно здоровых добровольцев и пациентов с меланомой и плоскоклеточным раком кожи средний возраст существенно различался. Однако в исследовании российских ученых показано, что распределение полиморфизма С-262Т гена каталазы значимо не изменяется в возрастных группах от 1 до 75 лет (Паук В.В. и др., 2008). Это сделало возможным сравнение полученных в данном исследовании распределений.
Для получения ДНК из биоптатов кожи производилась предварительная депарафинизация ксилолом с последующей спиртовой промывкой по стандартной методике. После этого образцы ткани инкубировались при температуре 55°С в течение ночи с визирующим раствором (комплект реагентов ДНК-сорб В, АгарНзепБ, Россия). Для получения ДНК из лейкоцитов образцы крови центрифугировались на скорости 2700 об./мин в течение 15 мин, затем лейкоциты отбирались в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и заливались лизирующим раствором (комплект реагентов ДНК-сорб В, Ат-рНзепБ, Россия). Дальнейшее выделение ДНК осуществлялось при помощи комплекта реагентов ДНК-сорб В (АтрНзепБ, Россия). Выделенные образцы ДНК хранились при температуре -20°С.
2.4.2 ПДРФ анализ
Для выявления мутации использовали метод анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ), описанный На§азака Т. е! а1. (2004).
Праймеры 5 ’-СТСАТААСССООАОССССОСССТОООТТСООАТАТ-3’ и 5 ’-СТАСвС АСОССААОАТШОААОСССААТСО-З ’ (ООО «Сибэн-зим», Новосибирск) были созданы по последовательности, описанной Х&х:-Ьоск Я. Щ ак (2007) для представления сайта рестрикции ЕсоЯ V (ВюЬаЬБ,