T-кадгерин в процессах роста, ремоделирования кровеносных сосудов и опухолевой прогрессии

• Автор: Рубина, Ксения Андреевна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2015
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 405 с. : ил. + Прил. (с. 242--405: ил.)

ВВЕДЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Регуляция роста и ремоделирования кровеносных сосудов

1.1.1 Клеточные компоненты сосудистой стенки

1.1.2 Механизмы формирования сосудов

1.1.3 Ветвление сосудов при ангиогенезе

1.1.4 Специализация клеток при ангиогенезе: “tip” и “stalk” фенотип

1.1.5 Филоподии и ламеллоподии определяют направление роста сосудов

1.1.6 Ангиогенные факторы роста

1.1.7 Хемокины и цитокины, их роль в процессах ангиогенеза
1.1.8 Роль интегринов в процессах ангиогенеза
1.1.9 Роль протеаз в процессах ангиогенеза
1.1.10 Эндогенные ингибиторы ангиогенеза
1.2 Навигационные рецепторы в нервной и сердечно-сосудистой системе
1.2.1 Эфрины и их рецепторы
1.2.2 Эфрины и их рецепторы в сосудистой системе
1.2.3 Семафорины и их рецепторы
1.2.4 Роль Семафоринов и их рецепторы в сосудистой системе
1.2.5 Нетрины и их рецепторы
1.2.6 Нетрины и их рецепторы в сосудистой системе
1.2.7 Слит лиганды и Robo рецепторы
1.2.8 Слит лиганды и Robo рецепторы в сосудистой системе
1.2.9 Урокиназная система
1.3 Кадгерины в процессах морфогенеза
1.3.1 «Классические» кадгерины
1.3.2 Экспрессия кадгеринов в нервной системе в эмбриогенезе
1.3.3 Роль кадгеринов в развитии сердца и сосудов
1.3.4 Т-кадгерин
1.3.5 Навигационная роль Т-кадгерина в нервной системе
1.3.6 «Гормоноподобные» эффекты липопротеидов низкой плотности (ЛНП). Т-кадгерин и ЛНП
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Антитела и реагенты
2.2 Культивирование эукариотических клеток
2.3 Трансфекция эукариотических клеток
2.4 Создание лентивирусных конструкций для трансдукции эндотелиальных клеток HUVEC
2.5 Создание аденовирусных конструкций для трансдукции эндотелиальных клеток HUVEC
2.6 Вестерн блоттинг (метод иммуноблоттинга)
2.6.1 Приготовление лизатов клеток
2.6.2 Определение концентрации белка в лизатах клеток
2.6.3 Вестерн блоттинг
2.7 Иммунофлуоресцентное окрашивание эндотелиальных клеток и конфокальная микроскопия
2.8 Измерение SRE активности в NIH3T3 клетках
2.9 Выделение активных Rho ГТФаз (GST pull-down assay-)
2.10 Измерение проницаемости эндотелиального монослоя in vitro
2.11 Тпипсинизация эндотелиальных клеток

2.12 Разделение лизатов клеток на субклеточные фракции
2.13 Оценка пролиферация эндотелиальных клеток
2.14 Метод измерения адгезии эндотелиальных клеток
2.15 Метод измерения апоптоза в эндотелиальных клетках
2.16 Измерение миграции эндотелиальных клеток в камере Бойдена
2.17 Метод изучения формирования капилляро-подобных структур эндотелиальными клетками
2.18 Экспериментальные животные
2.19 Анализ экспрессии Т-кадгерина в раннем эмбриональном развитии у мыши
2.19.1 Получение датированной беременности мыши
2.19.2 Получение эмбрионов мыши на постимплантационной стадии развития
2.19.3 Иммунофлуоресцентное окрашивание мышиных эмбрионов антителами против Т-кадгерина
2.19.4 Трансформация E.coli, амплификация и очистка плазмид для in situ гибридизации
2.19.5 Линеаризация плазмид для in situ гибридизации
2.19.6 Синтез РНК-содержащей пробы для in situ гибридизации
2.19.7. Гибридизация мышиных эмбрионов in situ
2.20 Эксплантная модель ex vivo аорты крысы
2.21 Подкожная имплантация Матригеля мышам
2.21.1 Оценка содержания гемоглобина
2.21.2 Выявление сосудов в Матригеле с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания
2.21.3 Подсчёт сосудов и статистический анализ
2.22 Приготовление криосрезов тканей человека и животных
2.23 Иммунофлуоресцентное окрашивание образцов биопсийного материала кожи человека
2.24 Модель гематогенно метастазируюшей в лёгкие меланомы у мышей in vivo
2.25 Анализ кинетики роста и метастазирования клеток меланомы B16F
2.26 Иммунофлуоресцентное окрашивание криосрезов первичных узлов меланомы
2.27 Модель хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона in vivo
2.28 Оценка пролиферации клеток B16F10 in vitro
2.28.1 Метод подсчёта абсолютного числа клеток
2.28.2 Метод измерения клеточного индекса
2.28.3 Оценка распределения клеток B16F10 по фазам клеточного цикла in vitro ..
2.29 Оценка уровня некроза и апоптоза клеток B16F10 in vitro
2.30 Анализ экспрессии генов в клетках клонов B16F10 in vitro
2.30.1 Выделение РНК
2.30.2 Синтез кДНК и полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени (RT-PCR)
2.30.3 Синтез кДНК и анализ профиля экспрессии генов с помощью наборов RT2 Profiler PCR Array
2.31 Концентрирование кондиционированной среды клеток B16F
2.32 Оценка инвазивного потенциала клеток B16F10 in vitro
2.33 Получение мезенхимных стромальных клеток жировой ткани (МСК-ЖТ) мыши
2.34 Влияние кондиционированной среды клеток B16F10 на пролиферацию и миграцию МСК-ЖТ in vitro
2.34.1 Влияние кондиционированной среды клеток B16F10 на пролиферацию МСК-ЖТ
2.34.2 Влияние среды от клеток клонов B16F10 на миграцию МСК-ЖТ
2.35 Статистическая обработка результатов

2.36 Иммуногистохимическое окрашивание криосрезов аорты человека
2.37 Выделение и йодирование липопротеидов низкой плотности
2.38 Определение поверхностного связывания иД-ЛНЛ с клетками
2.39 Определение концентрации внутриклеточного Са2+
2.40 Оценка влияния липопротеидов низкой плотности на миграцию L929 клеток ...150 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Выявление экспрессии Т-кадгерина в эмбриогенезе у мыши
3.1.1 Синтез РНК пробы
3.1.2 Экспрессия Т-кадгерина в эмбриональном головном мозге у мыши
3.1.3 Экспрессия Т-кадгерина в эмбриональном сердце
3.2 Т-кадгешн и опухолевая прогрессия
3.2.1 Т-кадгерин и опухолевый рост
3.2.2 Строма играет важную роль в регуляции роста и прогрессии опухолей
3.2.3 Т-кадгерин и васкуляризация опухолей
3.2.4 Потеря экспрессии Т-кадгерина в кератиноцитах и нарушение его экспрессии в сосудах коррелирует с процессами озлокачествления немеланомных новообразований кожи человека
3.2.4.1 Нормальная кожа
3.2.4.2 Псориаз
3.2.4.3 Актинический (солнечный) кератоз (АК)
3.2.4.4 Кератоакантома (КА)
3.2.4.5 Базальноклеточный рак (базалиома)
3.2.4.6 Плоскоклеточный рак или плоскоклеточная карцинома (ПР)
3.2.4.7 Метатипический рак (МР)
3.2.4.8 Потеря экспрессии Т-кадгерина в опухолевых клетках и нарушение его экспрессии в сосудах коррелирует с опухолевой прогрессией меланомы
3.2.4.9 Экспрессия Т-кадгерина в меланоме человека
3.3 Т-кадгерин и меланома
3.3.1 Анализ экспрессии Т-кадгерина в клетках мышиной меланомы B16F
3.3.2 Влияние экспрессии Т-кадгерина на пролиферацию клеток мышиной меланомы B16F10 in vitro
3.3.3 Влияние экспрессии Т-кадгерина на распределение клеток клонов B16F10 по фазам клеточного цикла in vitro
3.3.4 Влияние экспрессии Т-кадгерина на апоптоз и некроз клеток мышиной меланомы B16F10 in vitro
3.3.5 Влияние экспрессии Т-кадгерина на рост, метастазирование и васкуляризацию первичного узла меланомы B16F10 на модели гематогенно метастазирующей в лёгкие меланомы у мышей
3.3.5.1 Влияние экспрессии Т-кадгерина на рост первичного узла мышиной меланомы B16F10 in vivo
3.3.5.2 Влияние экспрессии Т-кадгерина на частоту очагов некроза на срезах первичных узлов меланомы B16F
3.3.5.3 Влияние экспрессии Т-кадгерина на васкуляризацию первичных узлов мышиной меланомы
3.3.5.4 Экспрессия Т-кадгерина в клетках меланомы вызывает активацию стромы и увеличивает вклад стромалъного компонента в формирование первичных узлов мышиной меланомы B16F
3.3.5.5 Изучение влияния экспрессии Т-кадгерина на метастазирование клеток
меланомы in vivo
3.3.6 Влияние среды роста от клеток клонов B16F10 на пролиферацию и миграцию
МСК-ЖТ in vitro
3.3.6.1 Влияние среды роста от клеток клонов B16F10 на миграцию МСК-ЖТ

содержание HIF-lß в клетках поддерживается на постоянном уровне, HIF-lanpn нормальном содержании кислорода гидроксилируется с помощью пролилгидроксилаз (PHD) и связывается с продуктом гена VHL, что вызывает убиквитин-зависимую деградацию комплекса в протеосомах. Гипоксия приводит к стабилизации HIF-la и формированию комплекса HIF-1, который при участии белка рЗОО взаимодействует с участком HRE (hypoxia responsive element) промотерной части регулируемых генов и стимулирует их транскрипцию [Semenza, 2010].
В условиях ишемии и гипоксии не только повышается HIF-la-опосредованная транскрипция генов ангиогенных факторов, но и увеличивается стабильность мРНК, кодирующих эти белки, в частности, VEGF [Stein, 1998]. Кроме того, снижение уровня кислорода в тканях вызывает активацию систем вторичных посредников (например, PI3K-Akt сигнального пути), что повышает выживаемость эндотелиальных клеток, активирует их пролиферацию и защищает от апоптоза [Hung, 2007; Semenza, 2010].
В последнее время накапливаются данные о посттранскрипционной регуляции ангиогенеза, а именно, с участием некодирующих микроРНК, которые активируют деградацию своих мишеней-мРНК или блокируют их трансляцию. В условиях гипоксии или гиперэкспрессии VEGF в сосудистых клетках экспрессируется целый спектр различных микроРНК, которые участвуют в регуляции процессов ангиогенеза [Carmeliet, 2011].
Повышение активности HIF-1 комплекса отмечается во многих типах опухолей, что связано с их активным ростом и высокой потребностью в кровоснабжении [Semenza, 2010].
1.1.7 Хемокины и цитокины, их роль в процессах ангиогенеза
Цитокины. К цитокинам относят интерфероны, колониестимулирующие
факторы, хемокины, трансформирующие ростовые факторы (TGF); фактор некроза опухолей (TNF); интерлейкины и некоторые другие эндогенные медиаторы. Цитокины по своему биологическому действию делятся на провоспалительные (интерлейкины 1, 2, 6, 8 и др., TNFa, INFy), противовоспалительные (интерлейкины 4, 10 и др., TGFß) и регуляторы клеточного и гуморального иммунитета. Цитокины влияют на межклеточные взаимодействия, регулируют выживаемость клеток, стимулируют или подавляют их пролиферацию, дифференцировку, функциональную активность и апоптоз, а также координируют и обеспечивают согласованность действий иммунной, эндокринной и нервной систем в нормальных условиях и в ответ на патологические воздействия [Strieter