Влияние звездчатых клеток печени на фенотип мезенхимных стволовых клеток крысы in vitro

• Автор: Шафигуллина, Айгуль Касыймовна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2013
• Место защиты: Казань
• Количество страниц: 114 с. : 28 ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1 ВВЕДЕНИЕ

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Микроокружение стволовых клеток

2.1.1 Общие понятия о микроокружении стволовых клеток

2.1.2 Микроокружение стволовых клеток печени

2.2 Компоненты микроокружения стволовых клеток печени

2.2.1 Растворимые факторы роста

2.2.2 Межклеточные контакты и внеклеточный матрикс

2.3 Внепечёночные стволовые клетки и регенерация печени

2.3.1 Гемопоэтические стволовые клетки в регенерации печени
2.3.2 Мезенхимные стволовые клетки в регенерации печени
2.3.2.1 Свойства мезенхимных стволовых клеток
2.3.2.2 Дифференцировка мезенхимных стволовых клеток в гепатоциты
2.3.2.2.1 Способность мезенхимных стволовых клеток
дифференцироваться в гепатоциты после трансплантации
2.3.2.2.2 Гепатоцитарная дифференцировка мезенхимных стволовых клеток in vitro
2.3.2.2.2.1 Гепатоцитарная дифференцировка мезенхимных стволовых клеток под действием факторов роста
2.3.2.2.2.2 Гепатоцитарная дифференцировка мезенхимных стволовых клеток под комплексным влиянием растворимых факторов и
межклеточных контактов
2.3.3 Механизмы дифференцировки стволовых клеток в гепатоциты
2.4 Звёздчатые клетки печени, их фенотип и свойства
2.4.1 Звёздчатые клетки печени как фактор микроокружения
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Выделение звёздчатых клеток печени
3.1.1 Выделение звёздчатых клеток печени методом коллагеназно-проназной перфузии с последующим разделением клеток в градиенте плотности гистоденза
3.1.2 Выделение звёздчатых клеток печени методом Сеглена
3.2 Выделение мезенхимных стволовых клеток из костного мозга
крысы
3.3 Изучение влияния компонентов микроокружения на дифференцировку клеток in vitro
3.3.1 Культивирование звёздчатых клеток печени и мезенхимных стволовых клеток с рекомбинантными факторами роста HGF и FGF4 (модель 1)
3.3.2 Культивирование мезенхимных стволовых клеток в питательной среде звёздчатых клеток печени (модель 2)
3.3.3 Культивирование мезенхимных стволовых клеток и звёздчатых клеток печени на внутрилуночных вставках (модель 3)
3.3.4 Совместное культивирование мезенхимных стволовых клеток и звёздчатых клеток печени (модель 4)
3.3.4.1 Методика витального мечения клеток флуоресцентными мембранными метками РКН26 и РНК67 (Sigma)
3.4 Методика иммуноцитохимического окрашивания культуры клеток
3.5 Молекулярно-биологические методы исследования экспрессии генов цитокератина 19 и VCAM в культуре звёздчатых клеток печени
3.5.1 Методика выделения тотальной РНК
3.5.2 Методика синтеза кДНК гена цитокератина 19 на матрице РНК
3.5.3 Электрофорез ДНК в 1,5% агарозном геле
3.5.4 Методика синтеза кДНК на матрице PFIK
3.5.5 Методика постановки ПЦР в режиме реального времени
4 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1 Сравнительный анализ методов выделения звёздчатых клеток из печени крыс
4.2 Фенотип свежевыделенных звёздчатых клеток печени и его изменения при культивировании
4.3 Культивирование звёздчатых клеток печени с рекомбинантными факторами роста
4.4 Фенотип свежевыделенных мезенхимных стволовых клеток и его изменения при культивировании
4.5 Фенотип мезенхимных стволовых клеток при культивировании с рекомбинантными факторами роста
4.6 Фенотип мезенхимных стволовых клеток при культивировании в питательной среде звёздчатых клеток печени
4.7 Изменения фенотипа мезенхимных стволовых клеток при культивировании их со звёздчатыми клетками печени на внутрилуночковых вставках
4.8 Изучение фенотипа звёздчатых клеток печени и мезенхимных стволовых клеток при совместном культивировании
5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6 ВЫВОДЫ
7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
8.БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ
ЛИТЕРАТУРЫ
9. СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

2.3.2.2.1 Способность мезенхимных стволовых клеток дифференцироваться в гепатоциты после трансплантации
Впервые способность костномозговых клеток дифференцироваться в гепатоциты была описана в экспериментах на крысах [33], а затем на мышах [52] и на человеке [149, 112]. Однако возможность дифференцировки МСК в гепатоциты in vivo до конца не установлена. С помощью магнитного мечения было установлено, что МСК, трансплантированные в воротную вену свиней, печень которых была повреждена D-галактозамином, мигрируют в паренхиму и синусоиды органа и сохраняются там как минимум в течение двух недель [153]. Показано также, что трансплантированные МСК приобретают в печени реципиентов фенотип гепатоцитов [10, 180, 192, 230]. Другими исследователями, Поппом [184] и Бертшингером [84], способность МСК дифференцироваться в гепатоциты при трансплантации их крысам с повреждением печени была поставлена под сомнение. При трансплантации МСК костного мозга в воротную вену дипептидил-пептидаза-1 V-дефицитным мышам с повреждением печени аллиловым спиртом или четырёххлористым углеродом введённые клетки встраивались в паренхиму, однако фенотипа гепатоцитов не приобретали [184]. Кроме того, в работе Бертшингера по трансплантации МСК мышам после частичной гепатэктомии и введения ингибитора митоза гепатоцитов ретрорзина трансплантированные клетки приобрели фенотип фибробластов и стали источником соединительной ткани [84].
При рассмотрении возможности трансплантации МСК для восстановления печени после повреждения неизбежно возникает вопрос о возможной дифференцировке трансплантированных клеток в фибробласты и их участии в фиброзировании печени. Мнения учёных по этому поводу также расходятся. Так, есть мнение, что трансплантация МСК не уменьшает уровень фиброза печени и не улучшает её функциональное состояние при тяжёлых хронических повреждениях органа [36], или даже способствует фиброгенезу [84]. Однако в работе Зао с коллегами было показано, что трансплантация МСК костного мозга