Морфометрико-стереологический анализ ультраструктуры митохондрий при окислительном стрессе

• Автор: Пилипенко, Даниил Игоревич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 152 с. : ил.

Содержание
Введение

Обзор литературы

I. Методы морфометрии и стереологии

1. Краткая история стереологии

2. Основные принципы стереологического анализа

2.1. Фундаментальные стереологические формулы и 10 преобразования

2.2. Методы подсчёта точек и пересечений

2.3. Принципы отбора снимков

2.4. Изотропные и анизотропные структуры

2.5. Выбор тестовых систем для стереологического анализа
2.6. Преимущества стереологических методов
3. Параметры, получаемые методами стереологии
3.1. Разнообразие стереологических параметров
3.2. «Дисектор» — метод подсчёта количества объектов
3.3. Метод расчёта поверхностной плотности
3.4. Метод расчёта объёмной плотности структуры
3.5. Стереологический анализ митохондрий
4. Альтернативные методы анализа пространственной 23 структуры объектов в электронной микроскопии
4.1. Метод трёхмерной реконструкции
4.2. Высоковольтная электронная микроскопия
II. Динамичность митохондрий, окислительный стресс и 24 антиоксидант БкСД
1. Динамичность и полиморфизм митохондрий
1.1. Внутриклеточная локализация митохондрий
1.1.1. Хондриом летательных мышц насекомых
1.1.2. Хондриом скелетных мышц
1.1.3. Хондриом кардиомиоцитов
1.2. Фрагментация и слияние митохондрий
1.2.1. Размеры и количество митохондрий
1.2.2. Фрагментация митохондриального ретикулума
1.2.3. Слияние митохондрий
1.2.4. Значение слияния и деления
1.3. Элиминирование митохондрий
1.3.1. Клетки хрусталика глаза

1.3.2. Созревание ретикулоцитов в эритроциты
1.3.3. Митоптоз и «энергетический шок»
1.4. Ультраструктура митохондрий
1.4.1. Общие представления
1.4.2. Корреляция с функциональным состоянием
2. Окислительный стресс
2.1. Генерация АФК в митохондриях
2.2. Антиоксидантная защита и митоптоз
2.2.1. Внутренняя мембрана и межмембранное пространство
2.2.2. Митохондриальный матрикс
2.2.3. Защита от перекисного окисления липидов
2.2.4. Пора во внутренней мембране и митоптоз
2.3. Роль окислительного стресса в старении и развитии патологий
2.3.1. Нейродегенеративные заболевания
2.3.2. Инфаркт миокарда
2.3.3. Возрастная макулодистрофия сетчатки
2.3.4. Процесс старения
2.4. Ультраструктура митохондрий при окислительном стрессе
3. Антиоксидант SkQi
III. Задачи работы
Результаты и методы
I. Изменения ультраструктуры митохондрий летательной мышцы 65 Drosophila melanogaster при естественном старении. Влияние антиоксиданта SkQi
1. Описание модели
2. Методы
3. Результаты
II. Изменения ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов мышей, 72 мутантных по PolgA, при ускоренном старении. Влияние антиоксиданта SkQi
1. Описание модели
2. Методы
2.1. Относительное количество сечений митохондрий
2.2. Анализ внутренней мембраны и матрикса митохондрий
3. Результаты
3.1. Относительное количество сечений митохондрий
3.2. Поверхностная плотность и объёмная доля внутренней 89 мембраны митохондрий

3.3. Относительная электронная плотность матрикса митохондрий
III. Изменения ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов крыс при 91 экспериментальном инфаркте миокарда. Влияние антиоксиданта БкСД
1. Описание модели
2. Методы
3. Результаты
IV. Ультраструктура клеток пигментного эпителия крыс линии ОХУ Б в 99 процессе старения. Динамика липофусциновых гранул. Действие 8к(Д
1. Описание модели
1.1. Крысы линии ОХУ Б и действие антиоксиданта 8к(Д
1.2. Описание экспериментальных групп
1.3. Описание состояния сетчатки крыс линии Vistar
1.4. Описание состояния сетчатки крыс линии ОХУБ
1.5. Описание состояния сетчатки крыс линии ОХУ8,
получавших антиоксидант 8к(Д в виде глазных капель
1.6. Количественная оценка: параметры
2. Методы
2.1. Электронная микроскопия
2.2. Статистическая обработка
2.3. Подсчёт относительного количества (плотности) 109 липофусциновых гранул и всех электронно-плотных гранул
2.4. Подсчёт площадей сечения электронно-плотных гранул
2.5. Подсчёт ширины зоны распределения электронно-плотных 111 гранул
3. Результаты
3.1. Относительное количество (плотность) липофусциновых 112 гранул
3.2. Относительное количество (плотность) электронно-плотных 114 гранул
3.3. Относительная средняя площадь сечения электронно-плотных 116 гранул
3.4. Ширина зоны распределения электронно-плотных гранул
3.5. Корреляция с балльной оценкой
Обсуждение результатов
Выводы
Список литературы

фрагментация митохондриального ретикулума и распределение образовавшихся фрагментов между дочерними клетками с последующим слиянием митохондрий в ретикулумы [Bereiter-Hahn, Vöth, 1994; Taguchi N., 2007].
На разных моделях методами световой микроскопии показано, что процесс фрагментации нитей митохондриального ретикулума начинается с образования бусо-подобных митохондрий, в которых отдельные расширенные части нити соединены между собой тонкими перетяжками [Skulachev et al., 2004]. Перетяжки становятся всё тоньше и, в результате, нить распадается на множество шаровидных или коротких вытянутых митохондрий. Через какое-то время митохондрии могут вновь слиться в ретикулум.
Если в клетке индуцирован апоптоз, наблюдается процесс перемещения и изменения пространственной организации хондриома. Небольшие митохондрии направляются к ядру и накапливаются в околоядерной зоне, а в очень редких случаях могут попадать даже внутрь ядра [Skulachev et al., 2004]. Кроме того, митохондрии переходят в ультраконденсированное состояние, образуя электронно-плотную и, по-видимому, уже нефункциональную структуру [Jia L. et al., 1997; Zhuang J. et al., 1998; Skulachev et al, 2004]. Затем такая структура может поглощаться аутофагосомой и подвергаться протеолитической деградации. Иногда можно наблюдать совместную локализацию конденсированного и нормального митопластов под общей внешней митохондриальной мембраной [Skulachev, 1999; Skulachev et al., 2004].
Показано, что при апоптозе фрагментация митохондрий происходит не сразу, а спустя некоторое время после добавления в среду апоптогенного фактора, при этом сама фрагментация происходит довольно быстро. Кроме того, показано, что фрагментация митохондрий предшествует их полной деэнергизации и высвобождению цитохрома с из межмембранного пространства [Skulachev et al., 2004].
Механизм фрагментации, по-видимому, основан на действии динамин-подобной ГТФ-азы Drpl (“dynamin-related protein 1”), которая при индукции апоптоза мигрирует из цитозоля на внешнюю поверхность митохондрий [Frank et al., 2002], олигомеризуется в кольца вокруг нитей и «раскусывает» нити подобно белку динамину, отщепляющему образующиеся эндоцитозные пузырьки от плазматической мембраны клетки [Vallee, 1993; Hinshaw, 2000]. Показано, что у клеток, с мутацией по гену Drpl, инактивирующей этот белок, фрагментация ретикулума не происходит. В клетках, лишённых Drpl, фрагментация митохондрий также не происходит [Smirnova et al., 1998; Labrousse et al., 1999; Smirnova et al., 2002].