Ответ устойчивых к апоптозу трансформированных клеток на действие рентгеновского излучения

• Автор: Шитикова, Жанна Валерьевна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 135 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

El. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Этапы канцерогенеза

2.2.Тумор-супрессорные програмы клетки

2.3. Апоптоз

2.4. Клеточное старение

2.4.1. Старение как тумор-супрессорная программа клетки

2.4.2 Маркеры клеточного старения
2.4.3. Роль DDR-ответа в индукции старения
2.4.4. Молекулярные механизмы формирования фокусов DDR
2.4.5. Механизмы репарации повреждений ДНК
2.5. Аутофагия
2.5.1. Формирование аутофагосом
2.5.2. Роль mTOR в регуляции старения и аутофагии
2.6. Ингибиторы гистоновых деацетилаз как перспективные противоопухолевые препараты
2.7. Характеристика клеток Е1А+Е1В
2.8. Заключение
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1. Материалы
3.1.1. Клеточные линии, использованные в работе
3.1.2. Антитела, использованные в работе
3.2. Методы
3.2.1. Культивирование клеток, облучение и обработка бутиратом
натрия
3.2.2. Построение кривых роста
3.2.3. Оценка жизнеспособности клеток
3.2.4. Анализ эффективности клонирования в редком посеве
3.2.5. Проточная цитофлуориметрия
3.2.6. Морфологическая окраска клеток гемаотоксилином и эозином
3.2.7. Анализ активности асоциированной со старением
р-галактозидазы (8А-р-Са1)
3.2.8. Анализ содержания ДНК в гигантских клетках с помощью
окраски по Фельгену и измерения интегральной оптической плотности
3.2.9. Иммуноблотинг
3.2.10. Иммунофлуоресцентная окраска клеток и конфокальная микроскопия
3.2.11. Имерение интенсивности флуоресценции
3.2.12. Анализ синтеза ДНК по включению ВгсЮ
3.2.13. Анализ синтеза ДНК по включения ЕсШ
3.2.14. Анализ разрывов ДНК с помощью щелочного гель-электрофореза одиночных клеток
3.2.15. Анализ нуклеосомной фрагментации ДНК
3.2.16. Статистический анализ
4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Устойчивые к апоптозу трансформанты Е1А+Е1В отвечают на облучение блоком С2/М и подавлением пролиферации,
но сохраненяют способность реплицировать ДНК
4.2. Сохранение репликативной активности при подавленной пролиферации приводит к формированию гигантских полиплоидных клеток с высокой генетической нестабильностью
4.3. Устойчивые к апотозу трансформанты Е1А+Е1В характеризуются нарушением организации ядерной ламины и хроматина

4.4. Облученные клетки Е1А+Е1В характеризуются нарушением DDR-ответа и персистенцией фокусов DDR
4.5. Репарация ДНК в клетках Е1А+Е1В после облучения нарушена
4.6. В ответ на облучение устойчивые к апоптозу трансформанты
El А+Е1В активируют обратимую программу старения
4.7. Активация обратимого старения, вызванного действием IR, в устойчивых к апоптозу клетках El А+Е1В сопровождается экспрессией маркеров стволовых клеток
4.8. Обратимость индуцированного облучением старения в клетках Е1А+Е1В связана с подавлением активности mTOR и активацией аутофагии
4.9. Бутират натрия индуцирует необратимую программу клеточного старения в трансформантах El А+Е1В
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

гибели клеток, индуцированной ингибитором каспаз zVAD, стауроспорином и этопозидом (Levine and Yuan, 2005).
Аутофагия часто выявляется в центральной части опухолей, где клетки испытывают недостаток кислорода и питательных веществ. Индукция аутофагии опухолевыми клетками происходит в ответ на различные виды терапии, включая облучение и действие ДНК-повреждающих препаратов. В этих случаях аутофагия способствует выживанию клеток за счет деградации поврежденных клеточных компонентов, а также обеспечения клетки нутриентами в условиях недостатка питательных веществ (Kroemer et al., 2010). Кроме этого, аутофагия является тумор-супрессорным механизмом клетки. Многие опухолевые супрессоры, такие как PTEN, TSC1/TSC2, р53 и ряд других, активируют аутофагию, тогда как онкогены, например PI3K, Akt и Ras, наоборот, подавляют ее. Действие широкого спектра противоопухолевых препаратов, включая цитостатики, HDACI и антагонисты гормонов, опосредуется активацией аутофагии (Kondo and Kondo, 2006; Yang et al., 2011).
В процессе старения происходят глобальные изменения многих клеточных процессов, таких как экспрессия генов и ремоделирование хроматина, накопливаются поврежденные белки и органеллы, что может приводить к активации аутофагии. В настоящее время не ясно, является ли аутофагия причиной или следствием активации программы старения, однако известно, что она явлется одним из важнейших эффекторных механизмов в индукции различных типов старения. Активация компонентов аутофагического пути имеет важное значение в формировании фенотипа стареющих клеток. Так, экспрессия Atg5 и Atg7 необходима для синтеза IL-6 и IL-8, являющихся компонентами SASP-фенотипа. Предполагается, что аутофагия способствует старению, по крайней мере, частично, путем установления SASP. Кроме аутофагии, участвующей в деградации общего пула поврежденных клеточных компонентов, существует также и селективная аутофагия. Возможно, что изменение статуса клетки