Влияние экзогенных липидов и антиоксидантов на выживаемость и функциональную активность клеток личинок моллюсков и иглокожих после криоконсервации

• Автор: Борода, Андрей Викторович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 109 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Устойчивость живых организмов к низким температурам

1.2 Причины гибели клеток при замораживании

1.2.1 Фазовый переход мембранных липидов

1.2.2 Кристаллизация воды

1.2.3 Осмо тический шок

1.2.4 Изменение pH

1.2.5 Изменения компонентов мембран клеток
1.2.6 Индукция апоптоза
1.3 Криопротекторы, используемые для защиты клеток при криоконсервации
1.3.1 Проникающие криопротекторы
1.3.1.1 Диметилсульфоксид
1.3.1.2 Спирты
1.3.2 Непроникающие криопротекгоры
13.2.1 Углеводы
1.3.2.2 Экзогенные липиды
1.3.2.3 Антиоксиданты
1.3.2.4’Низкомолекулярныс антифризы
1.4 Режимы замораживания-оттаивания
1.4.1 Одноэтапное замораживание
1.4.2 Ступенчатое замораживание
1.4.3 Оттаивание
1.5 Криоконсервация клеток и личинок беспозвоночных животных
ГЛАВА Т. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Животные
2.2 Методы
2.2.1Шолучение первичных культур)Клеток
2.2.2 Получение экстрактов липидов
2.2.3 Анализ состава жирных кислот липидов
2.2.4 Криопротекторы
2.2.5 Замораживание клеток
2.2.6 Оттаивание клеток
2.2.7 Оценка состояния клеток
2.2.7.1 Определение жизнеспособности клеток
г.2.1.1 МТТ-тест
2.2.13 Оценка пролиферативной активности клеток
2.2.7.4 Выявление ранних стадий апоптоза клеток
2.2.8 Криомикроскопия
2.2.9 Статистический анализ
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1 Оценка жизнеспособности клеток
3.1.1 Жизнеспособность клеток личинок мидии Ж (гохэШиэ
3.1.1.1 Оценка жизнеспособности клеток мидии с помощью двойной окраски^ флуоресцеин диацетат-пропидий йодид
3.1.1.2 Оценка жизнеспособности клеток мидии с помощью МТТ-теста
3.1.2 Жизнеспособность клеток личинок морского ежа & ШегтеМт
3.1.2.1 Оценка жизнеспособности клеток морского ежа с помощью двойной1 окраски флуоресцеин диацетат-пропидий йодид

3.2 Оценка морфологии и функциональной активности клеток
3.2.1 Морфология и функциональная активность клеток личинок мидии М. tross ulus
3.2.2 Морфология и функциональная активность клеток личинок морского ежа
S. intermedius
3.2.3 Выявление ранних стадий апоптоза клеток личинок морского ежа S. intermedius
3.3. Состав жирных кислот липидов
3.3.1 Выявление свободных жирных кислот в липидных экстрактах клеток личинок мидии М trossulus
3.3.2 Состав жирных кислот липидов мидии C. grayanus и ульвы U. fenestrata
3.3.3 Состав жирных кислот липидных экстрактов клеток личинок мидии М. trossulus
3.3.4 Состав жирных кислот липидных экстрактов клеток личинок морского ежа S. intermedius
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АСБ - аннексин-связывающий буфер;
АФБ - антифризные белки;
БДУ - 5-бромо-2'-дезоксиуридин;
БСА - бычий сывороточный альбумин;
ВГ - восстановленный глутатион;
ГЖХ - газо-жидкостная хроматография;
ДМСО - диметилсульфоксид;
ЖК - жирная кислота;
ИН - индекс ненасыщенности; к.о. - колоночный объем;
МЖК - моноеновые жирные кислоты;
МЛЭ - общий липидный экстракт из тканей мидии СгепотуШш £гауап№ МЛЭп - фракция полярных липидов из тканей мидии С. ^ауапш
МЛЭнп - фракция неполярных липидов из тканей мидии С. ауапий;
НЖК - насыщенные жирные кислоты;
СЖК - свободные жирные кислоты;
СМБББ - солевой раствор без Са2+ и М£2+;
СОД - супероксиддисмутаза;
ПЖК - полиеновые жирные кислоты;
ТСХ - тонкослойная хроматография;
УЛЭ - общий липидный экстракт из тканей зеленой водоросли Шуа
/епей^Мсг,
ФБ - фосфатный буфер;
ФИТЦ - флуоресцеинизотиоционат;
ФС - фосфатидилсерин;
Эх - эхинохром.

Индекс ненасыщенное (ИН) рассчитывали по формуле:
ИН = 2 С; х щ
Где Q - относительная концентрация индивидуальной ЖК, щ - число двойных связей в ней.
Для выявления свободных жирных кислот (СЖК) в общих липидных экстрактах клеток личинок М. trossnlus до и после замораживания использовали одномерную ТСХ на силикагелевых пластинках с системой гексан-диэтиловый эфир-муравьиная кислота (80:20:2, по объему). В качестве стандарта СЖК использовали смесь насыщенных жирных кислот 16:0, 18:0, 20:0, 22:0. Проявление ТСХ осуществляли опрыскиванием 10% H2S04 в метаноле и последующим нагреванием пластинок.
2.2:4 Крионротекторы
Растворы всех криопротекторов были приготовлены на стерильной морской воде. В качестве основных криопротекторов использовали диметилсульфоксид, этиленгликоль, глицерин, метанол (в концентрации 10%) и трегалозу (20%). Аликвоты экзогенных липидов (МЛЭ, МЛЭп, МЛЭнп, общего липидного экстракта ульвы U. fenestrata (УЛЭ), холестерина или лецитина) вносили в криозащитные смеси (конечная концентрация
0.085-0.15%), нагретые до 68-70°С, и обрабатывали ультразвуком (30 КГц, 1-2 мин) с помощью ультразвукового диспергатора (Labsonic, Германия). Стабильность липидных эмульсий проверяли на анализаторе размера частиц 3600Е (Malvern, Великобритания). Размеры липидных частиц в эмульсии при хранении при 4°С оставались неизменными в течение 3-4 сут. Введение более 0.15% липидных экстрактов в криозащитную смесь приводило к гибели клеток, возможно, связанной с токсическим действием хлороформа, содержащегося в этих экстрактах. При использовании менее 0.08% липидного экстракта эффективность применения данной криозащитной смеси начинает снижаться.