Участие экзогенной ДНК в репарационных процессах при повреждениях, индуцированных циклофосфаном и гамма-радиацией

• Автор: Лихачева, Анастасия Сергеевна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 119 с. : ил.

Автор выражает благодарность своему научному руководителю С.С. Богачеву за поддержку данной работы, за помощь в проведении экспериментов и анализе полученных данных. Автор благодарит М.А. Прохорович за работу с культурой эмбриональных стволовых клеток, В.П. Николина и H.A. Попову за помощь в проведении экспериментов с мышами, Т.Д. Дубатолову за помощь в подсчете форменных элементов крови. Отдельная благодарность всем сотрудникам и студентам Лаборатории молекулярной биологии клетки ИЦиГ СО РАН.
ОГ ЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ЕЕ Краткая история вопроса

1.2. Экстраклеточная ДНК плазмы крови человека

1.3. Поглощение ДНК эукариотической клеткой

1.4. Утилизация экстраклеточной ДНК, доставленной в ядро эукариотической клетки

1.5. Рекомбинация как возможный путь интеграции фрагментов экзогенной ДНК в реципиентный геном
1.5.1. Репарация по механизму гомологичной рекомбинации. Интеграция фрагментов экзогенной ДНК с использованием механизма гомологичной рекомбинации
1.5.2. Негомологичное объединение концов молекулы ДНК. Захват фрагментов ДНК
1.6. ДЦР как индукторы репарационно-рекомбинационных процессов в соматической клетке
1.6.1. Опознание повреждения и активация систем трансдуцирующих киназ
1.6.2. Функциональные ДЦР
1.6.2.1. Перетасовка генов иммуноглобулинов и генов ТСЛ
1.6.2.2. Реорганизация генома стволовых клеток, вступающих на путь дифференцировки
1.6.3. ДЦР, индуцированные внешним воздействием. Действие химиотерапии и облучения на систему кроветворения
1.6.3.1. Основные характеристики системы кроветворения млекопитающих
1.6.3.2. Угнетение системы кроветворения облучением
1.6.3.3. Метаболизм ЦФ в организме. Действие на систему кроветворения
1.6.3.4. Репарация возникших повреждений после облучения
1.6.3.5. Репарация повреждений после воздействия ЦФ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2Л. Препарат ДИК человека
2.2. Приготовление меченой ДНК
2.3. Культура клеток. Обработка клеток меченой ДНК
2.4. Выделение ДНК
2.4.1. Выделение ДНК клеточных компартментов
2.4.2. Метод заливки ядер в блоки легкоплавкой агарозы
2.4.3. Выделение ДНК из органов мышей
2.5. Приготовление препаратов ядер клеток костного мозга
2.6. ПЦР на предметных стеклах
2.7. Полимеразная цепная реакция
2.8. Электрофорез в агарозном геле
2.9. Секвенирование ПЦР фрагментов
2.10. Саузерн-блот гибридизации
2.11. Эксперименты с мышами
2.11.1. Схемы введения мышам препаратов в экспериментах по радиопротекции
2.11.2. Введение мышам ЦФ и ДНК человека
2.11.3. Введение мышам ДНК
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Радиопротекторное действие экзогенной фрагментированной ДНК
3.2. Воздействие кросслинкирующего цитостатика ЦФ и экзогенной ДНК на организм мышей
3.2.1. Влияние фрагментированной ДНК на выживаемость мышей после введения ЦФ
3.2.2. Поглощение экзогенной ДНК стволовыми клетками
3.2.2.1. Проникновение экзогенной ДНК в ядерное пространство эмбриональных стволовых клеток человека
3.2.2.2. Поглощение экзогенной ДНК клетками костного мозга мыши
3.2.3. Выявление фрагментов ДНК человека во фракции геномной ДНК экспериментальных животных после воздействия ЦФ и ДНК
3.2.3.1. ПЦР анализ геномной ДНК экспериментальных животных

организацию хроматина в сайте остановки репликативной вилки (Tibbetts et ai, 1999; Guo et ai, 2000; Liu et al., 2000; Ward, Chen, 2001; Cobb et al., 2005; Syljuäsen et al., 2005).
В результате описанных событий, протекающих после появления ДЦР. происходит арест клеточного цикла, формируется сигнал о появлении ДЦР в виде белковых комплексов на свободных двухцепочечных концах и клетка приступает к репарации повреждений.
1.6.2. Функциональные ДЦР
В некоторых клетках на определенной стадии развития появляются функциональные ДЦР. Можно выделить как минимум два типа клеток - клетки иммунной системы и стволовые клетки - где показано существование активной рекомбинационной системы, связанной с появлением в клетке функциональных разрывов хроматина.
1.6.2.1. Перетасовка генов иммуноглобулинов и генов TCR
При созревании Т-клеток потомки СКК лимфоидного ряда, предшественники Т-лимфоцитов, покидают костный мозг и локализуются в тимусе, где дифференцируются в незрелые тимоциты. Здесь в клетках происходит реорганизация V-, D-, J-сегментов ß-цепи TCR - V(D)J рекомбинация, в результате чего формируется разнообразие функционального TCR (Rodewaltl, Fehling, 1998; Pedraza-Alva et al., 2006). Реорганизация V-, D-, J-сегментов также необходимый шаг в созревании В-лимфоцитов при формировании функциональных генов иммуноглобулинов.
Как и любые другие, индуцируемые внешними факторами или остановкой репликативной вилки, ДЦР, индуцированные V(D)J рекомбинацией, активируют систему контроля прогрессии клеточного цикла, необходимую для завершения репаративного процесса и перехода клеток в митоз. Как оказалось, процесс мониторинга процесса рекомбинации осуществляет рЗ 8 МАР киназа. Ее акшвация ведет к аресту клеточного цикла на стадии G2/M в результате блокирования Rb/E2F комплекса фосфорилированным р53 либо инактивации Cdc25 фосфатазы.