Реакция стволовых клеток человека на тепловой стресс

• Автор: Алексеенко, Лариса Леонидовна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 134 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность исследования
Цель и задачи исследования
Основные положения, выносимые на защиту
Научная новизна работы
Теоретическое и практическое значение работы
Апробация работы
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Эмбриональные стволовые клетки
1.1.1. Получение ЭСК
1.1.2. Поддержание чЭСК
1.1.3. Дифференцировка ЭСК
1.1.4. Поверхностные антигены плюрипотентных клеток
1.1.5. Генетический контроль плюрипотентности
1.1.6. Эпигенетическая регуляция плюрипотентности
1.1.7. МикроРНК и плюрипотентность
1.1.8. Сигнальные пути, регулирующие плюрипотентность
1.1.9. Проблемы при культивировании ЭСК in vitro
1.1.10. Индукция плюрипотентности
1.2. Стволовые клетки (СК) взрослого организма
1.2.1. Маркеры стволовых клеток взрослого организма
1.2.2. СК костного мозга
1.2.3. Альтернативные источники МСК
1.2.4. МСК эндометрия
1.2.5. Сигнальные пути, регулирующие пролиферацию и дифференцировку СК взрослого организма
1.2.6. Перспективы использования МСК
1.3. Молекулярные и клеточные механизмы ответа на гипертермию
1.3.1. Стресс
1.3.2. Клеточный стресс

1.3.3. Семейство белков теплового шока(НЗР)
1.3.3.1. Малые белки теплового шока
1.3.3.2. Белки семейства НярбО
1.3.3.3. Белки семейства НБр
1.3.3.4. Белки семейства Няр
1.3.4. Транскрипционная регуляция экспрессии НБР
1.3.5. Активация сигнальных каскадов при температурном воздействии
1.3.6. Изменения клеточных структур после воздействия гипертермии
1.3.6.1. Воздействие гипертермии на клеточную мембрану
1.3.6.2. Воздействие гипертермии на цитоскелет
1.3.6.3. Воздействие гипертермии на цитоплазму и клеточные органоиды
1.3.7. Влияние гипертермии на клеточный цикл
1.3.8. Влияние гипертермии на репарацию ДНК
1.3.9. Гипертермия вызывает клеточную гибель
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Клеточные культуры, использованные в работе
2.2. Получение чЭСК
2.3. Культивирование чЭСК С
2.4. Криоконсервация и размораживание чЭСК
2.5. Получение и культивирование чЭСК-ДИФ
2.6. Получение и культивирование эМСК
2.7. Криоконсервация и размораживание эМСК
2.8. Построение кривых клеточного роста
2.9. Температурная обработка клеток
2.10. Проточная цитофотометрия
2.10.1. Иммунофенотипический анализ
2.10.2. Анализ клеточного цикла
2.11. Анализ апоптоза
2.12. Кариотипирование
2.13. Иммуноцитохимия
2.14. Определение активности щелочной фосфатазы
2.15. Направленная адипогенная, остеогенная и нейральная дифференцировка
2.15.1. Адипогенная дифференцировка
2.15.2. Остеогенная дифференцировка
2.15.3. Нейральная дифференцировка
2.16. Анализ экспрессии белков методом иммуноблоттинга
2.16.1. Приготовление проб для электрофоретического разделения белков
2.16.2. Электрофорез и иммуноблоттинг
2.17. Анализ генной экспрессии с помощью ОТ-ПЦР
2.18. Выявление активности SA-p-gal
2.19. Статистическая обработка результатов
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Клеточные линии, использованные в работе
3.1.1. Характеристика клеточной линии чЭСК C9I
3.1.2. Характеристика фибробластоподобных клеток (чЭСК-ДИФ)
3.1.3. Характеристика МСК человека, полученных из десквамированного эндометрия менструальной крови (эМСК)
3.2. Влияние ТШ на чЭСК и их дифференцированные производные чЭСК-ДИФ
3.2.1. Экспрессия белков теплового шока в чЭСК С910 и чЭСК-ДИФ
3.2.2. Тепловой шок индуцирует апоптоз в чЭСК, но не в их дифференцированных производных
3.2.3. Сублетальный ТШ (45 °С, 30 мин) вызывает стресс-индуцированное преждевременное старение (SIPS) в чЭСК-ДИФ
3.3. Свойства плюрипотентных чЭСК и их дифференцированных производных, переживших сублетальный ТШ
3.3.1. Свойства чЭСК С910, переживших сублетальный ТШ
3.3.2. Дифференцированные производные чЭСК, пережившие сублетальный ТШ, сохраняют свойства исходных клеток
3.4. Влияние ТШ на СК взрослого организма (эМСК)
3.4.1. Тепловой шок не индуцирует апоптоз в эМСК
3.4.2. ТШ индуцирует S1PS в эМСК
3.4.3. Экспрессия белков теплового шока в эМСК
3.4.4. Свойства эМСК, переживших сублетальное воздействие температуры
4. ОБСУЖДЕНИЕ
5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
6. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

некоторые авторы называют белки теплового шока белками стресса. Действительно, при воздействии неблагоприятных факторов индукция Hsp усиливается в несколько раз. В нормальных условиях члены семейства HSP конститутивно синтезируются в клетках и играют важную роль в процессах сворачивания полипептидной цепи вновь синтезированных белков, в процессах репарации или элиминации неправильно свернутых и денатурированных белков. Вероятно, именно поэтому Hsp обнаружены во всех организмах от бактерий до человека и относятся к группе наиболее консервативных белков.
1.3.3. Семейство белков теплового шока (HSP)
В семействе HSP можно выделить два основных класса в соответствии с их молекулярной массой. К первому классу относятся небольшие HSP с молекулярной массой не более 40 кДа (Hsp40, известен также как кошаперон Hsp70 или Hdjl, HSP32, HSP27, HSP 20 и др.) (Kregel, 2002). Второй класс включает HSP с высокой молекулярной массой 60-100 кДа (HSP60, HSP70, HSP90 и HSP110) (Hildebrandt et al., 2002). В настоящее время во избежание путаницы в описании конститутивно экспрессирующихся и индуцибельных белков, отнесенных к одному семейству, предложена другая номенклатура (Kampinga et al., 2009). Так, например, в соответствии с данной номенклатурой HSPA1A и HSPA1B являются аналогами двух изоформ стресс-индуцированного белка Hsp70, а конститутивная форма (Hsc70) обозначается HSPA8, малые белки ТШ (sHsps) - HSPB и т.д. Номенклатура некоторых представителей белков семейства HSP человека с альтернативными названиями приведена в Таблице 2 (Kampinga et al., 2009).
Таблица 2. Номенклатура некоторых представителей белков семейства НБР человека с
альтернативными названиями Семейство ШРА/ШР
Ген Белок Старое название № в Ген банке (ID)
1 HSPA1А HSPA1А HSP70-1; HSP72; HSPA1 3
2 HSPA1B HSPA1B HSP70-2 3
3 HSPA1L HSPA1L hum70t; hum70t; Hsp-hom 3
4 HSPA2 HSPA2 Heat-shock 70kD protein-2 3
5 HSPA5 HSPA5 BIP; GRP78; MIF2 3
6 HSPA6 HSPA6 Heat shock 70kD protein 6 (HSP70B1) 3