Регулятор клеточного цикла p21wan: роль в онкоген-индуцированной трансформации и клеточном старении

• Автор: Романов, Василий Сергеевич
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2011
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 122 с. : ил.

Оглавление

Список сокращений

ГЛАВ А 1. Введение

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

ГЛАВА 2. Обзор литературы

2.1. Клеточный цикл нормальных, трансформированных и стареющих клеток

2.2. Циклин-киназные комплексы и ингибиторы циклин-зависимых киназ

2.2.1. Циклин-киназные комплексы

2.2.2. Ингибиторы циклин- зависимых киназ

2.3. Маркеры клеточного старения

2.4. Трансформирующее действие онкогенов ElAad5 и cHa-ras
2.4.1. Влияние онкобелка El А на регуляцию событий клеточного цикла
2.4.2. Функции белка Ras
ГЛАВА 3. Материал и методы
3.1. Культивирование клеток
3.2. Кривые клеточного роста
3.3. Оценка эффективности клонирования
3.4. Оценка способности клеток пролиферировать независимо от прикрепления к
субстрату
3.5. Проточная цитометрия
3.6. Анализ количества белка
3.7. Иммуноблоттинг
3.8. Иммунопрецшштация и in vitro анализ киназной активности
3.9. Иммунофлуоресценция и цитохимия
3.10. Выявление активности SA-ß-Gal
3.11. Анализ фрагментированной ДНК в апоптотирующих клетках
3.12. Анализ транскрипции генов методом ОТ-ПЦР
3.13. Анализ миграции клеток по заполнению “раны” клеточного монослоя
3.14. Анализ миграции и инвазии клеток через поры мембран камер Бойдена
ГЛАВА 4. Результаты
4.1. Онкобелок Е1А, связываясь с p21Wafl, не препятствует его взаимодействию с
циклин-киназными комплексами в ГЛ4а<75/с7/а-га5-трапсформировапных фибробластах

4.2. Анализ клонов -трансфицированных фибробластов на содержание
введенных онкопродуктов и белков-регуляторов клеточного цикла
4.3. р21'УаГ1 и становление трансформированного фенотипа Е1А/сНа-1Хаз-
экспрессирующих фибробластов
4.3.1. Скорость пролиферации клеток тЕЫаз р21 -/- зависит от их плотности
4.3.2. р21у/аП вовлечен в дезорганизацию актинового цитоскелета ЕХА/сНа-ЛаБ-трансформ антов
4.3.3. Дезорганизация актинового цитоскелега и уменьшение фосфорилирования кофилина коррелируют с цитоплазматической локализацией р21>ЛГаГ1 в клетках тЕЛая
4.3.4. Роль р21'УаГ1 в миграции и инвазии Е1А/сНа-Лая-экспрессирующих фибробластов
4.3.5.Эффективность клонирования на пластике и пролиферация в полужидком агаре
Е1А/сНа-Лая-трансформантов зависят от р21у/аП
4.3.6. Стрессорные воздействия на Е.ХА/сНа-Лая-экспрессиругащие МЕИ не приводят к блоку клеточного цикла, но запускают апоптоз независимо от присутствия
р21шп
4.4. р21'¥аГ1 и активация клеточного старения ЕХА/сНа-Лая-экспрессирующих
фибробластов
4.4.1.ИаВ блоетрует прохождение тЕЛая и тЕЛаз р21-/- по клеточному циклу
4.4.2. Длительное действие №В вызывает необратимый блок клеточного цикла в трансформантах тЕЛая, но не тЕЛая р21-/
4.4.3. Маркеры клеточного старения не выявляются в клетках тЕЛая р21-/
4.4.4.Гипертрофия клеток тЕЛая, индуцированная №В, осуществляется за счет р21'УаП-оносредованной активации тТОЛС
4.4.5. ИаВ-индуцированное клеточное старение тЕЛаз сопровождается усилением адгезии клеток
4.4.6.Миграция клеток тЕЛая снижается при старении, а ингибитор киназного комплекса тТОЛС! рапамицин способен этому препятствовать
4.4.7.В становление ЫаВ-индуцированного клеточного старения клеток тЕЛая вовлечена стресс-киназа ШК, но не р
ГЛАВА 5. Обсуждение
Заключение
Выводы
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Список цитированной литературы

Список сокращений
БСА - бычий сывороточный альбумин ПААГ — полиакриламидный гель Adr - адраимицин
САК — Cdk activating kinase; Cdk-активирующая киназа СВР — CREB-binding protein CDC — cell devision cycle
CDK - cyclin-dependent kinase; циклин-зависимая киназа
Cip — Cdk interacting protein
CKI - Cyclin-kinase inhibitor
CR - conservative region; консервативный район
ECL - enchanced chemoluminescence; усиленная хемилюминесценция
ERK - exstracellular signal-regulated kinase
GAP - GTPase activating protein
GEF — guanine-nucleotide exchange factor
HDACi - histone deacetilase inhibitor; ингибитор деацстилаз гистонов
HHl — гистон HI
Ink4 — inhibitor of CDK
JNK - c-Jun N-terminal kinase
Kip - kinase inhibitory protein
LS — low serum; низкое содержание сыворотки
МАРК - mitogen activating protein kinase; МАР-киназа
MAPKKK - МАРК kinase kinase; киназа киназы MAP-киназы
MEF - mouse embrio fibroblasts; эмбриональные фибробласты мыши
mTOR - mammalian target of rapamycin
NaB - бутират натрия
PBS - phosphate buffer saline; фосфатный солевой буфер
PCNA — proliferating cell nuclear antigen
PI3K — Phospholnositide 3-Kinase
pRb - retinoblastoma protein; белок ретинобластомы
REF - rat embrio fibroblasts; эмбриональные фибробласты крысы
SA-p-Gal - Senescence-associated (3-galactosidase
Waf - Wild type p53 activated fragment

2.6. Трансформирующее действие онкогенов ElAad5 и cHa-ras
2.4.2. Влияние онкобелка Е1А на регуляцию событий клеточного цикла
Как уже было сказано, важным свойством нормальных клеток является строгая регуляция клеточного цикла и способность останавливать пролиферацию после стрессорных воздействий. С другой стороны, трансформация клеток вирусами эволюционно направлена на воспроизводство как можно большего количества вирусных частиц за счет ослабления контроля над клеточным циклом в сторону усиления пролиферативного процесса. Так, введение гена ElAad5 раннего района аденовируса пятого типа человека, в первичные клетки грызунов вызывает их иммортализацию, т.е. такие клетки приобретают способность делиться in vitro сколь угодно долго (Houweling et al., 1980).
Ген ElAad5 аденовируса человека пятого типа продуцирует пять типов мРНК, из которых два - 12S и 13S, кодирующие онкобелки 243 а.о. и 289 а.о. соответственно, являются основными (Frisch and Mymryk, 2002). Известно, что в составе обоих сплайс-форм онкобелков Е1Л присутствуют три эволюционно консервативных района - CR1, CR2, CR4, - тогда как у 289 а.о. белка присутствует еще и консервативный район CR3 (рис. 6А). N-концевой район Е1А и области CR1 и CR2 отвечают за трансформацию первичных клеток (Dorsman et al., 1995; Frisch and Mymryk, 2002), тогда как, CR3 содержит область, необходимую для активации транскрипции других аденовирусных и некоторых клеточных генов, отвечающих за регуляцию транскрипции ДНК, например, гены белков CBF (CCAAT-box-binding factor), TBP (TATA-binding protein) и др. (Agoff and Wu, 1994; Geisberg et al., 1994; Duyndam et al., 1996; Ablack et al., 2010). Функции консервативного района CR4, включающего последовательность Pro-Leu-Asp-Leu-Ser на С-конце Е1А (Avvakumov N. et al., 2002), до конца не изучены, однако известно, что он отвечает за связывание и инактивацию транскрипционных корспрессоров семейства CtBP (Schaeper ct al., 1995).
Трансформирующее действие онкобелка El А на клетки основано на его взаимодействии со многими негативными регуляторами клеточного цикла, что вызывает подавление их активности. В частности, мишенями Е1А являются белки семейства ретинобластомы - pRb, р107, р130 (Whyte et al., 1988), коактиваторы транскрипции рЗОО и СВР (Arany et al., 1994), а также ингибиторы циклин-киназных комплексов p21Wafl и р27юр1 (Nomura et al., 1998; Keblusek et al., 1999) (рис. 6A). Показано, что за взаимодействие El А с белками семейства ретинобластомы отвечают