Разработка тканеинженерной конструкции на основе мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани, полилактидных носителей и тромбоцитарного геля для восполнения костного дефекта

• Автор: Бухарова, Татьяна Борисовна
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2014
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 161 с. : ил.

Оглавление

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Строение и регенерация костной ткани

2.2 Развитие клеточных технологий для регенерации костной ткани

2.3 Характеристика и остеогенный потенциал культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани

2.4 Матрицы-носители для тканеинженерных конструкций

2.5 Использование обогащенной тромбоцитами плазмы крови в тканевой инженерии

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Выделение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека
3.2 Иммунофенотипический анализ мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани
3.3 Дифференцировка мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека
3.4. Получение и дифференцировка культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани крыс
3.5 Получение полилактидных матриц-носителей
3.6 Заселение и культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека на носителях
3.7 Оценка цитотоксичности материала носителей и пролиферативной активности клеток на носителях с помощью МТТ-теста
3.8 Визуализация клеток с использованием мембранной метки РКН26
3.9 Изучение морфологии клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии
3.10 Получение обогащенной тромбоцитами плазмы крови
3.11 Изготовление тканеинженерных конструкций

3.12 Оценка жизнеспособности клеток внутри тканеинженерной конструкции in vitro
3.13 Трансплантация тканеинженерных конструкций крысам
3.14 Подготовка и обработка гистологических срезов
3.15 Статистический анализ данных
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Характеристика культур мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани
4.2 Выбор оптимальных условий остеогенной дифференцировки мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток жировой ткани человека
4.3 Оценка цитосовместимости матриц-носителей
4.4 Характеристика тканеинженерной конструкции
4.5 Морфологическое исследование области введения тканеинженерной конструкции в толгцу мышечной ткани бедра крыс
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ
5.1 Выбор культуры остеогенных клеток
5.2 Обоснование выбора матриц-носителей
5.3 Получение тканеинженерных конструкций
5.4 Трансплантация тканеинженерных конструкций в бедренную мышцу крыс
Заключение
Выводы
Список литературы
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ММСК - мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки ЖТ - жировая ткань
СВФ - стромально-васкулярная фракция ТИК - тканеинженерная конструкция ДМСО - диметилсульфоксид
МТТ - тетразолиум (3-(4,5-диметилтиазолил-2)-2,5-дифенилтетразолиум бромид
ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка ИЛ - IL/интерлейкин
КОЕ-Ф - колониеобразующие единицы фибробластов р-ТКФ - Р-трикальций фосфат ФСБ - фосфатно-солевой буфер БСА - бычий сывороточный альбумин ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота СЭМ - сканирующая электронная микроскопия ПСЛС - поверхностно-селективное лазерное спекание ГКИТ - гигантские клетки инородных тел
DMEM/F12 - Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham/ Среда Игла, модифицированная Дульбекко/питательная смесь Хэма F
BMP - bone morphogenetic protein/костный морфогенетический белок
PRP - platelet-rich plasma/плазма, обогащенная тромбоцитами
CD - cluster of differentiation, кластер дифференцировки (мембранные маркеры)
FGF - fibroblast growth factor/фактор роста фибробластов

обусловлено законодательным разрешением в этой стране с 2009 г трансплантаций аутологичных ММСК ЖТ после минимального процессинга.
Остеогенный потенциал ММСК ЖТ продемонстрирован в многочисленных экспериментах на животных и отдельных клинических исследованиях. Важно, что для реализации этого потенциала необходимо применение эффективных остеогенных индукторов, выбор которых основан на исследовании механизмов их действия.
2.4 Матрицы-носители для тканеинженерных конструкций
На данный момент определены основные требования, предъявляемые к физико-механическим и медико-биологическим свойствам материалов носителей тканеинженерных конструкций. Материал должен быть биосовместимым, т.е. являться надлежащим субстратом для поддержания клеточной активности, в том числе на уровне внутриклеточных сигнальных процессов, ведущих к оптимальной регенерации ткани. Также понятие биосовместимости предполагает отсутствие каких-либо нежелательных эффектов при in vivo тестировании - отсутствие местных воспалительных и аллергических реакций [Williams, 2003]. Еще одно важное требование -биорезорбируемость материала, т.е. разрушение под действием биологических факторов и иммунных клеток организма с образованием нетоксичных компонентов, вовлекаемых в метаболические пути.
Все материалы, используемые для производства носителей ТИК для костной пластики можно разделить на несколько групп: 1) неорганические материалы, такие как трикальцийфосфаты, биокерамика, 2) полимеры природного происхождения - белковые молекулы внеклеточного матрикса (коллаген), 3) синтетические полимеры - в основном поли-а-гидроксикислоты и 4) композитные материалы на основе комбинации нескольких компонентов различной природы [Srouji, 2006].