Роль малых G-белков в регуляции эпителиальных натриевых каналов

• Автор: Старущенко, Александр Викторович
• Шифр специальности: 03.03.04
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 218 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
Список сокращений
1 ВВЕДЕНИЕ
2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
2.1 Эпителиальные натриевые каналы
2.1.1 Deg/ENaC семейство ионных каналов
2.1.2 Физиологическая значимость ENaC и болезни, опосредованные патологиями в структуре/регуляции канала
2.1.3 Структрурно-фупкционапъная организация ENaC
2.1.4 Биофизические свойства ENaC
2.1.5 Механизмы регуляции ENaC
2.2 Малые G-белки
2.3 Регуляция ионных каналов малыми G-белками семейства Ras
2.4 Регуляция ионных каналов малыми G-белками семейства Rho
2.5 Регуляция ионных каналов малыми G-белками семейства Rab
2.6 Регуляция ионных каналов фосфатидшшнозитидами
2.7 Заключение
3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
3.1 Клетки
3.2 Материалы
3.3 Электрофизиология
3.4 Растворы
3.5 Флуоресцентная микроскопия
3.6 Биохимические эксперименты
3.7 Обработка результатов
4 РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Стехиометрия ENaC и моделирование структуры ENaC на основе ASIC каналов
4.1.1 Использование FIR анализа и TIRF микроскопии для определения стехиометрии мембранных белков
4.1.2 Соотношение a:ß, ß:y и а:у ENaC субъединиц, определенное с помощью FIR/TIRF анализа, составляет 1:1 Электрофизиологический анализ стехиометрии ENaC
4.1.3 подтверждает, что функциональный канал состоит из равного количества субъединиц
4.1.4 Моделирование структуры ENaC на основе cASICl
4.2 Регуляция ENaC малым G-белком K-Ras
4.2.1 Реконструирование ENaC в клетки СНО
4.2.2 K-Ras увеличивает активность канала не оказывая влияния на ёмкость клеток
4.2.3 K-Ras увеличивает активность ENaC GTP-зависимым образом
4.2.4 K-Ras активирует ENaC через Р13-киназу
4.2.5 Р1(3,4,5)Р3 влияет на воротные свойства канала
4.2.6 Регуляция ENaC Р13-киназой в нативных клетках
4.3 Регуляция ENaC малыми G-белками Rho семейства
4.3.1 Rho Л котролирует работу канала в эпителиальных клетках
4.3.2 RhoA и Rad, в отличие от Cdc42, активируют ENaC ПО
4.3.3 RhoÄ активирует ENaC последовательно через Rho-киназу и Р1(4)Р 5-киназу
4.3.4 RhoA увеличивает количество ENaC в плазматической мембране
4.3.5 Активация RhoA способствует быстрой транслокации и встраиванию ENaC в плазматическую мембрану
4.3.6 RhoA и K-Ras независимо влияют на активность ENaC, действуя через параллельные сигнальные пути
4.4 Регуляция ENaC малыми G-белками Rab семейства
4.4.1 Идентификация малых G-белков в семействе Rab, влияющих на активность ENaC
4.4.2 Механизм регуляции ENaC малым G-белком Rabl 1а
4.4.3 Колокализация ENaC и Rabl 1а
4.5 Молекулярные механизмы Р1(3,4,5)Рз и Р1(4,5)Р2 регуляции ENaC
4.5.1 Механизмы Р1(3,4,5)Р3 регуляции ENaC
4.5.2 Механизмы Р1(4,5)РЧ регуляции ENaC
5 ОБСУЖДЕНИЕ
6 ВЫВОДЫ
7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ENaC - Epithelial Na+ Channel - эпителиальный Na+ канал
ASIC - Acid Sensing Ion Channel — протон-чувствительный ионный канал
CFTR - Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator — анионный канал
ассоцированный с заболеванием муковисцидоз
Р0 — вероятность открытого состояния
ВАХ - вольт-амперная характеристика
Е - потенциал
Ерев. - потенциал реверсии
мВ - милливольт
мин — минут
пА, нА - пикоампер, наноампер пФ - пикофарад пСм - пикосименс
патч-кламп — метод локальной фиксации потенциала PI3-K - фосфатидилинозитид-3-киназа Р1(4,5)Р2 - фосфатидилинозитид-4,5-бисфосфат Р1(3,4,5)Р3 - фосфатидилинозитид-3,4,5-трифосфат
Малый G-белок - Small G protein - Small GTPase - малый
гуаниннуклеотидсвязывающий регуляторный белок
СНО — Chinese Hamster Ovary cells — клетки яичника китайского хомячка
CFP - cyan fluorescence protein - голубой флуоресцентный белок
YFP - yellow fluorescence protein - жёлтый флуоресцентный белок
TIRF - Total Internal Reflection Fluorescence - флуоресценция полного
внутреннего отражения
FRAP - Fluorescence Recovery After Photobleaching - восстановление флуоресценции после фотовыжигания
FRET — Fluorescence Resonance Energy Transfer - передача энергии посредством флуоресцентного резонанса

Таблица 1. Регуляция ионных каналов малыми в-белками Кая семейства.
Малый G-белок Ионный канал Эффект Источник
Ras Предсердный К+ канал Ингибирует Yatani et al., 1
Ha-Ras Са2+ канал Т-типа Увеличивает активность Hahnei et al., 1
Ha-Ras ЖК1 Уменьшает актиность влияя на внутриклеточный трафик Giovannardi et al., 2
RGK семейство Са2+ канал Ь -типа Ингибирует экспрессию на клеточной мембране Beguin et al., 2001 Finlinet al., 2003 Ward et al., 2004 Finlin et al., 2
Rem2 Са2+ канал N -типа Блокирует активность Chen et al., 2
H-Ras Потенциалзависимый 1№ Увеличивает потенциал действия Imamura et al., 2
Rapl Потенциалзависимый 1ыа Ингибирует потенциал действия Imamura et al., 2